Isolation and identification of protein binding to anion exchanger 1 (AE1) in human kidney

การแยกและการค้นหาโปรตีนที่มีปฏิสัมพันธ์กับโปรตีนแอนไอออนเอ็กซ์เซ็งเจอร์-วันในไตของมนุษย์

Name: Thitima Keskanokwong

MeSH: Anion Exchange Protein 1, Erythrocyte

MeSH: Protein Transport

Abstract: Kidney anion exchanger 1 (kAE1) mediates Cl-/HCO3 - exchange at the basolateral membrane of kidney α-intercalated cells. It is an isoform of erythroid AE1 (eAE1) and lacks 65 amino acids at its amino terminus. This may cause some structural changes and altered protein-protein interaction in kAE1. Several mutations in the AE1 gene have been found and associated with Distal Renal Tubular Acidosis (dRTA). The proposed mechanism of the dRTA is involved in defects of protein trafficking or mis-targeting to an appropriate site of the α-intercalated cells. Both the C- and N-termini of kAE1 are required for correct basolateral localization of proteins in polarized epithelial cells. However, the human proteins interacting with the Nterminus have not been identified. Therefore, this study aimed to identify proteins interacting with NkAE1 that may be involved in the kAE1 trafficking. Yeast twohybrid screening revealed interactions with several proteins including integrin-linked kinase (ILK), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and pantophysin (PPH). Interaction between kAE1 and the selected proteins was demonstrated in the co-expression experiments including co-immunoprecipitation, affinity co-purification and immunofluorescence staining in human embryonic kidney (HEK 293) cells. Interestingly, cell surface biotinylation results showed that ILK, but not GAPDH and pantophysin, promoted cell surface expression of kAE1. ILK also enhanced Cl- /HCO3 - transport activity of kAE1 in line with the observed increase of cell surface expression. Mapping analysis revealed that kAE1 interacts with the C-terminus of ILK through the kAE1 calponin homology (CH) domain. In addition, the ankyrin repeats, PH domain and kinase activity of ILK were not required for binding ability to kAE1 and cell surface expression of kAE1. ILK also interacted with eAE1 suggesting that lack of the 65 amino acids of kAE1 would not alter the folded structure of CH domain in eAE1. However, overexpression of ILK did not significantly increase cell surface expression of eAE1 when compared with that of kAE1 in which ILK might play a role in an isoform specific manner as a key protein to increase the level of kAE1 on the cell surface of the kidney cells. Further investigation found that ILK promotes kAE1 expression at the cell surface in HEK 293 cells by forming kAE1- ILK-paxillin-actopaxin complex links kAE1 to the actin cytoskeleton. This study presents data demonstrating that ILK provides a linkage between kAE1 and the underlying actin cytoskeleton to stabilize kAE1 at the plasma membrane, resulting in the higher level of cell surface expression.

Abstract: โปรตีน kidney anion exchanger 1 (kAE1) ทำหน้าที่ในการแลกเปลี่ยนคลอไรด์กับไบคาร์บอเนตที่ basolateral membrane ของเซลล์ขับกรดในไต โปรตีนนี้เป็น isoform ของ erythroid anion exchanger 1 (eAE1) โดยมีกรดอะมิโน 65 ตัวที่ปลายอะมิโนน้อยกว่า eAE1 ซึ่งอาจมีผลทำให้โปรตีนทั้งสองมีปฏิสัมพันธ์ต่อโปรตีนที่ เกี่ยวข้องแตกต่างกัน มิวเตชั่นของยีน AE1 มีหลายชนิดที่เกี่ยวข้องกับการเกิดโรคไตผิดปกติในการขับกรด ได้มี การตั้งสมมุติฐานว่าการเปลี่ยนแปลงของโปรตีน AE1 จากผลของมิวเตชั่น อาจนำไปสู่ความผิดปกติของการขนส่ง โปรตีน หรือการเคลื่อนย้ายของ kAE1 ไปยังตำแหน่งที่ไม่เหมาะสม การศึกษาต่อมาพบว่าทั้งปลายอะมิโน และ ปลายคาร์บอกซี่ ของ AE1 เป็นส่วนสำคัญในการควบคุมการขนส่งและการเคลื่อนย้ายโปรตีนไปยังตำแหน่งที่ ถูกต้อง ปัจจุบันยังไม่พบ โปรตีนที่จับกับปลายอะมิโนของ kAE1 (NkAE1) ตลอดจนความเข้าใจกลไกการขนส่ง kAE1 โดยผ่านโปรตีนตัวอื่นในเซลล์ของไตมนุษย์ยังไม่มีผู้ศึกษามาก่อน วัตถุประสงค์ของการศึกษานี้คือ การ ค้นหาโปรตีนที่จับกับ NkAE1 ด้วยวิธี yeast two-hybrid จากนั้นคัดเลือกโปรตีนที่ได้ คือ integrin-linked kinase (ILK), glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase และ pantophysin นำมาวิเคราะห์ในรายละเอียดเพื่อศึกษา ปฏิสัมพันธ์กับ kAE1 ด้วยวิธี co-immunoprecipitation, affinity co-purification และ immunofluorescence staining ในเซลล์เพาะเลี้ยง HEK 293 ผลการวิเคราะห์ยืนยันความจำเพาะของการจับของโปรตีนทั้งสามกับ NkAE1 แต่ การศึกษาด้วยวิธี cell surface biotinylation แสดงให้เห็นว่าเฉพาะ ILK ที่เพิ่มการแสดงออกของ kAE1 ที่ผิวเซลล์ นอกจากนี้ ILK ยังทำให้มีการเพิ่มการแลกเปลี่ยนไอออนของ kAE1 อย่างชัดเจน ทำให้ได้ข้อสรุปว่า ILK น่าจะมี บทบาทต่อการขนส่ง kAE1 โดยใช้ calponin homology (CH) domain ของ kAE1 ในการจับกับปลายคาร์บอกซี่ ของ ILK ในขณะที่ ankyrin repeats, PH domain และ ผลของ phosphorylation ของ ILK ไม่มีส่วนเกี่ยวข้อง นอกจากนี้ยังพบว่า ILK สามารถจับกับ eAE1 ได้ แสดงว่ากรดอะมิโน 65 ตัวที่ปลายด้านอะมิโนของ eAE1 ไม่มี ผลต่อการม้วนพับของโครงสร้างของ eAE1 ที่เปลี่ยนแปลงไปโดยเฉพาะในส่วนของ CH domain การศึกษานี้บ่งชี้ ว่าการจับกันของ kAE1 และ ILK เป็นส่วนของกลุ่มโปรตีนที่ประกอบด้วย kAE1 ILK paxillin และ actopaxin โดยสรุปการศึกษานี้แสดงให้เห็นว่า ILK เป็นตัวเชื่อมที่สำคัญระหว่าง kAE1 กับ cytoskeleton โดยผ่าน actin ที่ สามารถจับกับกลุ่มโปรตีนนี้ได้ ซึ่งทำให้การคงอยู่ของ kAE1 ที่ plasma membrane มีเสถียรภาพเป็นผลให้มีการ แสดงออกของ kAE1 ที่ผิวเซลล์ในระดับที่สูงขึ้น

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Varaporn Akkarapatumwong

Role: Thesis Advisors

Created: 2007

Modified: 2553-06-18

Issued: 2010-06-11

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: TH T448is 2007

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Molecular Genetics and Genetic Engineering

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4536651.pdf	4.48 MB	11	2018-05-29 12:24:26

ใช้เวลา

0.405043 วินาที