Identification of cadherin-like protein in Aedes aegypti larvae

การโคลนและการจำแนกยีนสร้างโปรตีนตัวเหมือนแคดฮีรีนในลูกน้ำยุงลาย

Name: Mongkhon Panyot

LCSH: Aedes aegypti

MeSH: Cadherins

MeSH: Densovirinae

MeSH: RNA Interference

Abstract: The insecticidal crystal proteins, produced from bacterium Bacillus thuringiensis, bind to specific receptors on the midgut epithelial cells of susceptible insect larvae, leading to pore formation and death of the larvae. Cadherin-like protein (CadLP) is considered a receptor to Cry toxins in many insect species but its expression in the gut of Aedes aegypti larvae is unknown. This study identified and cloned CadLP from the midgut of Ae. aegypti larvae using RT-PCR, 5´ and 3´ RACEs. 1,498 nucleotides located at the 3´ end of CadLP cDNA from Ae. aegypti larval midgut were obtained. The obtained partial sequence has 57% amino acid sequence similarity to An. gambiae CadLP. Moreover, RNAi technique was employed to specifically knock down the CadLP expression to determine if this protein is necessary for Cry4Ba toxin larvicidal activity against Ae. aegypti. Two ways for introducing the dsCadLP RNA into the larvae were employed. One, feeding the larvae with E. coli expressing dsCadLP RNA. Two, soaking the larvae in dsCadLP RNA solution. Semi-quantitative RT-PCR was employed to monitor the expression of CadLP transcripts. The results showed that the soaking method showed reduction of CadLP transcripts. The silencing of the CadLP gene by soaking is sequence specific as soaking the larvae in dsGFP RNA did not result in reduction of CadLP transcripts. The mosquito larvicidal assay was performed after 12, 24 or 36 hours of soaking in dsCadLP RNA. The results did not show reduction of larval mortality and there was no reduction of CadLP transcript as expected. Therefore, the experiments as well as the soaking experiment are inconclusive

Abstract: แบคทีเรีย Bacillus thuringiensis สามารถผลิตโปรตีนสารพิษที่เป็นพิษจำเพาะต่อตัวอ่อน ของแมลง โดยโปรตีนสารพิษนี้จะจับอย่างจำเพาะต่อตัวตอบรับซึ่งอยู่บนเยื่อหุ้มเซลล์กระเพาะ อาหารส่วนกลางของตัวอ่อน และเป็นสาเหตุการตายของตัวอ่อนแมลงดังกล่าว เนื่องจากการศึกษา ในแมลงหลายชนิดพบว่า Cadherin-like protein (CadLP) น่าจะเป็นตัวตอบรับจำเพาะต่อ โปรตีน Cry แต่อย่างไรก็ตามตัวตอบรับจำเพาะต่อโปรตีน Cry4Ba ซึ่งมีพิษจำเพาะต่อลูกน้ำยุงลาย (Aedes aegypti) ยังไม่มีการพิสูจน์แต่อย่างไร ในการศึกษานี้จึงต้องการที่จะโคลนและแยกยีน CadLP นี้จากกระเพาะอาหารส่วนกลางของลูกน้ำยุงลายโดยวิธี RT-PCR, 5´- และ 3´ RACEs จากผลการศึกษาพบว่า cDNA ลำดับนิวคลีโอไทด์บางส่วนด้านปลาย 3´ ของ CadLP ที่ได้ขณะนี้ คือ 1,498 ตัว เมื่อเปรียบเทียบในฐานข้อมูล cDNA พบว่ามีลำดับอะมิโนที่คล้ายกับ CadLP จาก ยุงก้นปล่อง Anopheles gambiae 57% ในการทดลองครั้งนี้ได้ทำเทคนิค RNA interference มา ใช้เพื่อยับยั้งการแสดงออกของ CadLP ในลูกน้ำยุงด้วยสองวิธีคือ การให้ลูกน้ำยุงลายกิน E. coli ซึ่งสร้างอาร์เอ็นเอสายคู่ (dsRNA) ที่จำเพาะต่อการกำจัดเอ็มอาร์เอ็นเอ (mRNA) ของยีน CadLP ในลูกน้ำและการแช่ลูกน้ำยุงลายลงในสารละลายอาร์เอ็นเอสายคู่ที่จำเพาะต่อการกำจัดเอ็มอาร์เอ็น เอของยีน CadLP ในลูกน้ำยุง หลังจากนั้นจึงทำการตรวจสอบปริมาณเอ็มอาร์เอ็นเอของยีน CadLP ด้วยวิธี RT-PCR ผลการทดสอบพบว่าเพียงวิธีแช่ลูกน้ำลงในสารละลายอาร์เอ็นเอสายคู่ พบยับยั้งการแสดงออกของยีน CadLP ได้และพบว่าเป็นการยับยั้งแบบจำเพาะเจาะจง หลังจากการ แช่ลูกน้ำยุงลายลงในสารละลายอาร์เอ็นเอสายคู่ที่จำเพาะต่อการกำจัดเอ็มอาร์เอ็นเอของยีน GFP และไม่พบการลดลงของการแสดงออกของยีน CadLP การศึกษาการตายของยุงลายหลังการแช่ ลูกน้ำยุงลายในสารละลายอาร์เอ็นเอสายคู่ที่จำเพาะต่อการกำจัดเอ็มอาร์เอ็นเอของยีน CadLP เป็น เวลา 12, 24 และ 36 ชั่วโมง แล้วจึงให้ลูกน้ำยุงกิน E.coli ซึ่งสร้างโปรตีน Cry4Ba ผลการทดสอบ พบว่าเปอร์เซ็นการตายของลูกน้ำยุงไม่ลดลงเมื่อเทียบกับลูกน้ำยุงที่ไม่ได้ยับยั้งการแสดงออกของ ยีน CadLP อีกทั้งไม่พบการยับยั้งการแสดงออกของยีน CadLP ด้วย ดังนั้นผลการทดสอบในส่วน การศึกษาการตายของยุงและการแช่ลูกน้ำยุงลงในสารละลายอาร์เอ็นเอสายคู่จึงยังไม่สามารถสรุป ได้

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Kusol Pootanakit

Role: Thesis Advisors

Created: 2007

Modified: 2553-06-17

Issued: 2010-06-11

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: TH M743i 2007

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Molecular Genetics and Genetic Engineering

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4737246.pdf	2.45 MB	10	2021-11-11 16:23:29

ใช้เวลา

0.303313 วินาที