Cloning, expression and biological properties of type 1 ribosome-inactivating protein from the seeds of spiny bitter cucumber ‪(Momordica Cochinchinensis)‬

การโคลนยีนการแสดงออกและคุณสมบัติทางชีววิทยาของโปรตีนที่มีฤทธิ์ยับยั้งไรโบโซมประเภทที่ 1 จากเมล็ดของต้นฟักข้าว

Name: Juthamas Chuethong

LCSH: Cochinin B

LCSH: Momordica cochinchinensis Spreng

LCSH: Plant proteins

MeSH: Cucurbitaceae

MeSH: DNA Glycosylases

MeSH: Ribosomes

Abstract: Cochinin B, a novel ribosome-inactivating protein (RIP) with a molecular weight of 28 kDa, was purified from the seeds of spiny bitter cucumber (Momordica cochinchinensis), by cation-exchange chromatography on a SP Sepharose column and size-exclusion chromatography on a Superdex 75 column with a fast protein liquid chromatography (FPLC) system. The purified Cochinin B displayed a strong inhibitory activity on protein synthesis in the cell-free rabbit reticulocyte lysate system with IC50 of 0.36 nM. Furthermore, it exhibited N-glycosidase activity and cytotoxicity against Vero cell line with IC50 higher than 1,540 nM. Interestingly, Cochinin B manifested strong antitumor activities on human cervical epithelial carcinoma (HeLa), human embryonic kidney (HEK293) and human small cell lung cancer (NCI-H187) cell lines with IC50 of 16.9, 114 and 574 nM, respectively. In addition, antitumor analyses by observation of cell morphology, annexin V assay, DNA fragmentation assay and western blotting of apoptosis-related proteins indicated that Cochinin B inhibited Hela cells via apoptotic pathway To further characterize this protein, cDNA clones were isolated from genomic DNA and total RNA using the degenerative primer designed from the N-terminal amino acid sequence. The entire cDNA contained 925 nucleotides in length and encoded the mature Cochinin B of 259 amino acids. Cochinin B had nearly 60-80% similarity to several type 1 RIPs from the Cucurbitaceae family. The nucleotide sequence encoding mature Cochinin B was constructed in the pET28a vector for overexpression in Escherichia coli strain BL21 (DE3). The recombinant protein was purified to homogeneity by Ni Sepharose Fast Flow chromatography with a final yield of about 0.3-0.5 mg/liter of culture. It was found that the protein inhibited luciferase mRNA translation in the rabbit recticulocyte cell-free system with an IC50 value of approximately 16.25 nM. The anti-protliferative activity on HeLa cell line was also investigated.

Abstract: Cochinin B เป็นโปรตีนที่มีฤทธิ์ยับยั้งการทำงานของไรโบโซม ประเภทที่ 1 มีน้ำหนัก โมเลกุล 28 กิโลดาลตัน ซึ่งแยกให้บริสุทธิ์จากเมล็ดของต้นฟักข้าว (Momordica cochinchinensis) โดยใช้ คอลัมน์ SP Sepharose ซึ่งอาศัยหลักการแลกเปลี่ยนประจุบวก (cation-exchange chromatography) และ คอลัมน์ Superdex 75 ซึ่งอาศัยหลักการแยกขนาด (size-exclusion chromatography) โดยต่อคอลัมน์เข้ากับ ระบบ fast flow protein chromatography (FPLC) โปรตีน Cochinin B ที่บริสุทธิ์แสดงฤทธิ์ยับยั้งการ สังเคราะห์โปรตีนในระบบที่ปราศจากเซลล์โดยใช้ reticulocyte lysate ของกระต่ายแสดงค่า IC50 ที่ 0.36 นาโนโมลาร์ นอกจากนั้นยังมีฤทธิ์ N-glycosidase และค่าความเป็นพิษต่อเซลล์ Vero ที่ IC50 สูงกว่า 1,540 นาโนโมลาร์ ที่น่าสนใจคือ Cochinin B มีฤทธิ์ยับยั้งเซลล์มะเร็งที่แรงต่อเซลล์ human cervical epithelial carcinoma (HeLa) เซลล์ human embryonic kidney (HEK293) และเซลล์ human small cell lung cancer (NCI-H187) โดยมีค่า IC50 ที่ 16.9 114 และ 574 นาโนโมลาร์ ตามลำดับ นอกจากนี้พบว่าฤทธิ์ยับยั้งมะเร็ง ของ Cochinin B ต่อเซลล์ HeLaนั้นเกิดจากการเหนี่ยวนำให้เซลล์เกิด apoptosis ซึ่งสังเกตจากลักษณะของ เซลล์ การย้อมด้วย Annexin V การเกิดการแตกหักของ DNA และการทำ western blotting ของโปรตีนที่ เกี่ยวข้องกับ apoptosis เพื่อการศึกษาลักษณะของโปรตีนนี้ โคลนของ cDNA ที่ได้จากจีโนมิกดีเอ็นเอและอาร์ เอ็นเอ โดยการออกแบบไพร์เมอร์จากลำดับกรดอะมิโน ลำดับนิวคลิโอไทด์ทั้งหมดคือ 925 เบส ซึ่ง สังเคราะห์เป็นกรดอะมิโนทั้งหมด 259 ตัว Cochinin B มีความใกล้เคียงกับโปรตีนที่มีฤทธิ์ยับยั้งไรโบโซม ประเภทที่ 1 จากพืชในวงศ์ Cucurbitaceae ประมาณ 60-80 เปอร์เซนต์ ลำดับนิวคลิโอไทด์ที่สังเคราะห์ โปรตีน Cochinin B ได้นำเข้าเวคเตอร์ pET28a เพื่อจะทำให้เกิดการแสดงออกในแบคทีเรีย E. coli สาย พันธุ์ BL21 (DE3) โปรตีนที่ได้ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยผ่านคอลัมน์นิเกิลเซฟาโรส ซึ่งได้ปริมาณโปรตีนสุทธิ ประมาณ 0.3-0.5 มิลลิกรัมต่ออาหารเลี้ยง 1 ลิตร พบว่าโปรตีนที่ได้สามารถยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีนใน ระบบที่ปราศจากเซลล์โดยแสดงค่า IC50 ที่ 16.25 นาโนโมลาร์ และได้ทดสอบฤทธิ์ยับยั้งเซลล์มะเร็ง HeLa ของโปรตีนดังกล่าวด้วย

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Wichet Leelamanit

Role: Thesis Advisors

Created: 2007

Modified: 2553-06-17

Issued: 2010-06-10

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: TH J96c 2007

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Biopharmaceutical Sciences

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4537375.pdf	5.93 MB	198	2022-12-04 15:00:40

ใช้เวลา

0.264061 วินาที