Use of green fluorescent protein for subcellular localization study of papaya ringspot potyvirus P3 protein

การใช้โปรตีนเรืองแสงสีเขียวในการศึกษาตำแหน่งภายในเซลล์ของโปรตีน P3 ของไวรัสโรคใบด่างจุดวงแหวน / Sarasate Eiamtanasate

Name: Sarasate Eiamtanasate

LCSH: Plant Diseases|xmicrobiology

MeSH: Endoplasmic Reticulum

MeSH: Hydrophobicity

MeSH: Potyvirus

Abstract: Papaya ringspot potyvirus (PRSV) causes a severe disease in papayas. Its genome is a single messenger-polarity RNA which is translated into a polyprotein that is processed into 10 functional proteins. The P3 protein, encoded by the 3rd cistron has been proposed to be involved in viral replication, pathogenicity determination and host specificity. However, its exact function/s and subcellular localization in infected cells still remain unclear. Therefore, the objective of this study was to determine the subcellular localization of PRSV P3 by expressing its green fluorescent (GFP) fusion protein in onion epidermal cells, in order to further understand its function/s. Plant expression vectors containing P3 or its derivatives fused with gfp gene were constructed and expressed transiently in onion epidermal cells. Single or cobombardment of each of the above constructs with an endoplasmic reticulum (ER) targeted DsRed2 construct (ER-DsRed2) indicated that GFP fusion proteins of P3- , P3-6K1- and N-terminal truncated P3 (CP3-6K1-GFP) were localized at ER, whereas those of 6K1- and C- terminal truncated P3 (NP3-GFP) were expressed all over the transfected cells as for the free GFP. These results suggested that P3 is localized at ER, and the localization determinant sequence is located at its Cterminus. The result also indicated that the presence of 6K1 protein, encoded by the 4th cistron, does not affect the localization of P3 protein as suggested in other reports. The lack of ER-targeted sequence suggested that the presence of hydrophobic region/s within the P3 protein might contribute to its ER localization. Therefore, hydrophobic region prediction was performed and 2 hydrophobic regions located at the N- and C-terminal region of P3 protein respectively were found. A construct which express the second hydrophobic region (Hy2) fused with GFP in plant cell was created and expressed in onion epidermal cells. The results indicated that Hy2 GFP fusion protein co-localized with the ER-DsRed2 fusion protein. These data confirm that the Hy2 which is located at the C-terminal region is the localization determinant sequence for PRSV P3 protein.

Abstract: ไวรัสโรคใบด่างจุดวงแหวนเป็นสาเหตุของการเกิดโรคที่รุนแรงในมะละกอ ซึ่งมีจีโนมเป็นอาร์เอ็นเอ สายเดี่ยวที่ถูกแปลรหัสเป็นโปรตีนขนาดใหญ่ก่อนที่จะผ่านกระบวนการย่อยให้เป็นโปรตีนที่สามารถทำงาน ได้จำนวน 10 ชนิด P3 เป็นโปรตีนลำดับที่ 3 ของไวรัสที่ถูกสันนิษฐานว่ามีส่วนเกี่ยวข้องกับการเพิ่มจำนวน ของไวรัส การก่อโรค และความจำเพาะของพืชเจ้าบ้าน อย่างไรก็ดีหน้าที่และตำแหน่งของ P3 ภายในเซลล์ ที่ติดโรคยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด วัตถุประสงค์ของการศึกษานี้คือการหาตำแหน่งของ P3 ภายในเซลล์โดยการ สร้างโปรตีนลูกผสมที่ประกอบด้วยส่วนของ P3 และโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (green fluorescent protein, GFP) เพื่อใช้ในการศึกษาการแสดงออกของโปรตีนในเซลล์เยื่อหอม ทำการสร้างเวคเตอร์หลายชนิดที่มีชิ้นส่วนดีเอ็นเอของ P3 ส่วนต่าง ๆ และ/หรือ 6K1 และยีนที่ สร้าง GFP เพื่อให้มีการสร้างโปรตีนลูกผสมหลายรูปแบบภายในเซลล์เยื่อหอมจากนั้นนำเวคเตอร์ข้างต้น เข้าสู่เซลล์เยื่อหอมโดยการยิงอนุภาคโดยลำพังหรือร่วมกับเวคเตอร์ที่สร้างโปรตีนเรืองแสงสีแดง (ER-DsRed2) ที่มีตำแหน่งจำเพาะอยู่ที่ endoplasmic reticulum (ER) ผลการศึกษาพบว่า โปรตีนลูกผสมที่มีส่วนของ P3 หรือ P3-6K1 หรือ P3 ที่ขาดส่วนปลายอะมิโนสามารถพบได้ที่ ER ในขณะที่โปรตีนลูกผสมที่มีส่วนของ 6K1 เท่านั้น หรือ P3 ที่ขาดส่วนปลายคาร์บ๊อกซี่สามารถพบกระจาย อยู่ทั่วทั้งเซลล์ ผลนี้บ่งชี้ว่า P3 สามารถพบได้ที่ ER โดยมีส่วนปลายคาร์บ๊อกซี่ของ P3 เป็นส่วนสำคัญต่อ การระบุการไปสู่ตำแหน่งเป้าหมายที่ ER นอกจากนี้ยังพบว่า 6K1 ไม่มีผลต่อ P3 ในการไปสู่ตำแหน่งที่ ER และไม่พบว่ามีลำดับกรดอะมิโนที่เป็น ER-targeted ใน P3 จากผลดังกล่าวสันนิษฐานว่าการที่พบ P3 ได้ที่ ER นั้นอาจมีผลมาจากการที่โปรตีนมีส่วนที่ไม่ชอบน้ำเป็นส่วนสำคัญในการระบุตำแหน่งเป้าหมาย ดังนั้นการศึกษานี้ได้ทำการทำนายหาส่วนที่ไม่ชอบน้ำและพบว่า P3 มีส่วนดังกล่าวอยู่ในทั้งส่วนปลายอะมิโน และปลายคาร์บ๊อกซี่ (Hy2) มาสร้างโปรตีนลูกผสมกับ GFP และพบว่ามีตำแหน่งอยู่ที่ ER เช่นเดียวกับ โปรตีนลูกผสม GFP ที่มีส่วนของ P3 หรือ P3-6k1 หรือ P3 ที่ขาดส่วนปลายอะมิโน การศึกษานี้แสดงให้ เห็นว่า Hy2 เป็นส่วนสำคัญต่อการระบุการไปสู่ตำแหน่งเป้าหมายที่ ER ของ P3

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Yun-Kiam Yap

Role: Thesis Advisor

Created: 2007

Modified: 2553-06-21

Issued: 2010-06-09

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: TH S243u 2007

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Molecular Genetics and Genetic Engineering

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4437582.pdf	61.36 MB	38	2026-05-26 18:16:01

ใช้เวลา

-0.557613 วินาที