Comparison of molecular methods : Nested, multiplex and real-time PCR for the speciation of human plasmodium

การเปรียบเทียบวิธี nested, multiplex และ real-time PCR เพื่อการจำแนกชนิดของเชื้อมาลาเรีย

Name: Prapaporn Boonma

MeSH: Communicable Diseases -- microbiology

MeSH: Gene Expression

MeSH: Plasmodium falciparum

MeSH: Plasmodium vivax

MeSH: Polymerase Chain Reaction

Abstract: Malaria remains an important disease and is most prevalent along the Thai- Myanmar and Thai-Cambodia borders. The aim of this study was to compare three molecular techniques; nested PCR, multiplex PCR, and real-time PCR for the detection and speciation of Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax from dried blood spots. The results were also compared to microscopic examination of Giemsa stained slides. Some 136 volunteers seeking care at malaria clinics, Pong Nam Ron, Chanthaburi and Suan-Pueng, Ratchaburi provinces were identified as being infected with malaria by blood film analysis from March to October 2006. When these were examined by microscopy, 32 (23.53%) cases were P. falciparum, 53 (38.97%) cases were P. vivax, 4 (2.94%) cases were mixed P. falciparum-P. vivax infections and 47 (34.56%) cases were negative. All the extracted DNA (QIAGEN) samples were detected by nested PCR, multiplex PCR and real-time PCR. 40 (29.41%) P. falciparum, 51 (37.5%) P. vivax infections and 45 (33.1%) negative cases were identified by multiplex PCR. P. falciparum, P. vivax, mixed and negative infections at 37 (27.21%), 51 (37.5%), 4 (2.94%) and 44 (32.35%), respectively were identified by nested PCR while 37 (27.2%) P. falciparum, 51 (37.5%) P. vivax, 3 (2.21%) mixed and 45 (33.1%) negative cases were detected by real-time PCR. Microscopy was the least sensitive and specific of the four diagnostic methods used in this study when utilizing molecular consensus as the gold standard. Microscopy has a sensitivity of 94.17%; however it was more sensitive in detecting mixed infections than multiplex PCR, which failed to detect any. The lowest limited detections of nested PCR; multiplex PCR and real-Time PCR methods to DNA of P. falciparum, P. vivax were 0.045, 2.01; 0.0091, 0.23 and 0.005, 0.028 parasites/μl respectively. When the cost of each PCR technique was compared, we found that real-time PCR was cheapest (reagent only) of 6.89 $US. However, the sensitivity of nested PCR, multiplex PCR and real-time PCR for the speciation of Plasmodium spp. were equal of 96.63%. The molecular methods used in this study will and can be a very useful complement to microscopic analysis in order to obtain the real incidence of each species and also for the follow-up of patients after specific treatment with the ultimate goal of reducing the occurrence of misdiagnosis in field laboratories in Thailand.

Abstract: โรคมาลาเรียยังคงเป็นปัญหาสาธารณสุขที่สำคัญของประเทศไทยโดยเฉพาะแถบชายแดนไทย พม่า และชายแดนไทยกัมพูชา การศึกษาครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อเปรียบเทียบวิธีทางอณูชีววิทยาได้แก่ NESTED, MULTIPLEX และ REAL-TIME PCR เพื่อจำแนกชนิดของเชื้อมาลาเรียเปรียบเทียบกับวิธี ตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ กลุ่มตัวอย่างจำนวน 136 ตัวอย่าง เป็นผู้ป่วยที่มีอาการของโรคมาลาเรียจาก มาลาเรียคลินิกอำเภอสวนผึ้ง จังหวัดราชบุรีและอำเภอโป่งน้ำร้อน จังหวัดจันทบุรี ตั้งแต่เดือนมีนาคมถึง เดือนตุลาคม พ.ศ. 2548 การตรวจโดยใช้กล้องจุลทรรศน์พบการติดเชื้อ Plasmodium falciparum จำนวน 32 (23.53%) ราย, Plasmodium vivax จำนวน 53 (38.97%) ราย และ การติดเชื้อผสม (P. vivax - P. falciparum) จำนวน 4 (2.94%) ราย และไม่พบการติดเชื้อจำนวน 47 (34.56%) ราย การตรวจโดยวิธี Multiplex PCR พบ P. falciparum จำนวน 40 (29.41%) ราย, P. vivax จำนวน 51 (37.5%) ราย และไม่ พบการติดเชื้อจำนวน 45 (33.1%) ราย การตรวจวินิจฉัยโดยวิธี Nested PCR พบ P. falciparum จำนวน 37 (27.21%) ราย, P. vivax จำนวน 51 (37.5%) ราย พบการติดเชื้อแบบผสม จำนวน 4 (2.94%) ราย และ ไม่พบการติดเชื้อ 44 (32.5%) ราย สำหรับการตรวจโดยวิธี Real-Time PCR พบการติดเชื้อ P. falciparum จำนวน 37 (27.2%) ราย, P. vivax จำนวน 51 (37.5%) ราย การติดเชื้อแบบผสมจำนวน 3 (2.21%) ราย และไม่พบการติดเชื้อ 45 (33.1%) ราย จากผลการศึกษาพบว่าการตรวจวินิจฉัยโดยใช้กล้องจุลทรรศน์มี ความไวและความจำเพาะน้อยที่สุดโดยมีความไวเพียง 94.17% แต่อย่างไรก็ตามเมื่อพิจารณาถึงการตรวจ การติดเชื้อแบบผสมพบว่า การตรวจวินิจฉัยโดยใช้กล้องจุลทรรศน์จะมีความไวมากกว่าการตรวจโดยวิธี Multiplex PCR ซึ่งไม่สามารถตรวจพบการติดเชื้อแบบผสมได้ และพบว่าปริมาณ DNA ที่น้อยที่สุดที่ สามารถตรวจด้วยวิธี Nested PCR; Multiplex PCR และ Real-Time PCR ต่อ P. falciparum, P. vivax เท่ากับ 0.045, 2.01; 0.0091, 0.23 และ 0.005, 0.028 parasites/μl เมื่อเปรียบเทียบการตรวจจำแนกเชื้อ มาลาเรียมีความไวเท่ากันทั้งสามวิธีคือ 96.63% และเมื่อเปรียบเทียบค่าใช้จ่ายของวิธี PCR พบว่า realtime PCR เสียค่าใช้จ่าย(สารเคมี)น้อยที่สุด (255 บาท) ในประเทศไทยการตรวจวินิจฉัยโดยวิธีทางอณู ชีววิทยาสามารถนำมาใช้ประกอบกับการตรวจวินิจฉัยโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เพื่อประโยชน์ในการ ติดตามผลการ รักษาหลังจากให้การรักษาที่จำเพาะและยังจะสามารถช่วยลดการวินิจฉัยที่ผิดพลาดได้

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Usa Lek-Uthai

Role: Thesis Advisors

Created: 2006

Modified: 2553-06-25

Issued: 2010-06-08

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: TH P899co 2006

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Infectious Diseases and Epidemiology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4837528.pdf	1.64 MB	47	2019-01-25 22:41:25

ใช้เวลา

0.311461 วินาที