Functional eulucidation of Domain III of the Bacillus thuringiensis Cry4Ba toxin

การศึกษาหน้าที่ของ domain III ของโปรตีน cry4ba จากแบคทีเรีย bacillus thuringiensis

Name: Poramed Chayaratanasin

MeSH: Bacillus thuringiensis

MeSH: Histochemistry

MeSH: Immunohistochemistry

MeSH: Surface Plasmon Resonance

Abstract: It has been suggested that the C-terminal domain III of Bacillus thuringiensis Cry δ-endotoxins is involved in various functions including structural integrity, receptor binding and ion-channel regulation. In this study, eleven mutants (Y537A, Y543A, Y543R, Y543E, Y543Q, Y543I, R540A, R542A, R542K, R542E, and R542Q) of conserved residues located in β17 within domain III of the Cry4Ba mosquito-larvicidal toxin were constructed and shown to be critical for structural integrity. Toxicity assays against Stegomyia aegypti mosquito larvae suggested that positive charge at Arg542 and hydrophobicity at Tyr543 are pivotal for Cry4Ba toxicity. Furthermore, the cloned Cry4Ba-domain III fragment was functionally characterised via surface plasmon resonance spectroscopy, demonstrating that the 21-kDa domain III protein tightly binds to the immobilised artificial phospholipid membrane via twostep manner with a similar rate of dissociation to that of the full-length Cry4Ba toxin. In the proteinase K protection assays, the membrane-bound form of both proteins was partially resistant to proteinase K digestion. This revealed that the domain III fragment alone was able to associate with and possibly embed itself within the lipid membrane. In vitro binding analysis via immuno-histochemical assay revealed that the Cry4Badomain III protein was able to bind to the apical microvilli of the susceptible S. aegypti larval midguts, albeit at lower-binding activity when compared with the 65- kDa full-length active toxin. This demonstrated that the Cry4Ba-domain III protein conceivably participates in toxin-receptor recognition. Unlike the full-length toxin, the Cry4Ba-domain III fragment could not induce leakage of calcein-entrapped liposome or display any ion channel activity on receptor-free phospholipid bilayers, indicating no membrane-destabilising activity. For toxicity assays, the cloned Cry4Ba-domain III protein did not display toxicity against either S. aegypti larvae or S. albopictus C6/36 cell lines. Altogether, these studies suggest that the cloned Cry4Ba-domain III protein plays a role in maintaining structural integrity, membrane binding, and receptor recognition.

Abstract: จากงานวิจัยที่ผ่านมาเสนอว่า domain III ของโปรตีนสารพิษจากแบคทีเรีย Bacillus thuringiensis สามารถทำหน้าที่ในการรักษาเสถียรภาพของโครงสร้างโปรตีน การจับกับโปรตีน ตัวรับจำเพาะหรือการควบคุมการไหลผ่านของอิออน ในการศึกษานี้โปรตีนกลายพันธุ์ (Y537A, Y543A, Y543R, Y543E, Y543Q, Y543I, R540A, R542A, R542K, R542E และ R542Q) ได้ถูกสร้างขึ้นจากการเปลี่ยนแปลงกรดอะมิโนซึ่งมีความอนุรักษ์สูงที่อยู่บน β17 ใน domain III ของโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุงชนิด Cry4Ba และพบว่าตำแหน่งเหล่านี้มีความสำคัญต่อเสถียรภาพของ โครงสร้างโปรตีน เมื่อทดสอบความเป็นพิษต่อลูกน้ำยุงลาย (Stegomyia aegypti) พบว่า positive charge ของ Arg542 และความเป็นไฮโดรโฟบิคของ Tyr543 มีความสำคัญต่อการออกฤทธิ์ฆ่าลูกน้ำ ยุง เมื่อศึกษาบทบาทการทำงานโดยใช้เทคนิค surface plasmon resonance พบว่าชิ้นส่วน domain III ที่แยกบริสุทธิ์ได้ซึ่งมีขนาด 21 กิโลดาลตัน สามารถจับกับเยื่อหุ้มเซลล์จำลองโดยผ่าน สองขั้นตอนและมีค่าคงที่ของสมดุลของการแยก (dissociation rate constant) คล้ายกับของ โปรตีนเต็มขนาด 65 กิโลดาลตันและพบว่าเมื่อโปรตีนทั้งสองชนิดที่จับกับเยื่อหุ้มเซลล์แล้วจะถูก ย่อยโดย proteinase K ได้เพียงบางส่วนแสดงว่าชิ้นส่วน domain III สามารถจับกับเยื่อหุ้มเซลล์ ดังกล่าวโดยอาจจะฝังตัวอยู่ภายใน นอกจากนี้เมื่อศึกษาโดยใช้วิธี immunohistochemistry พบว่า ชิ้นส่วน domain III สามารถจับกับส่วนบนสุดของเซลล์บุผิวของกระเพาะลูกน้ำยุงลายได้แม้ใน ปริมาณที่น้อยกว่าโปรตีนเต็มขนาดแสดงว่า domain III น่าจะเกี่ยวข้องกับการจับกับตัวรับจำเพาะ เมื่อศึกษาเพิ่มเติมพบว่าชิ้นส่วน domain III ไม่สามารถทำให้เกิดการแตกของ liposome หรือการ เกิดรูอิออนได้และเมื่อทดสอบความเป็นพิษพบว่าชิ้นส่วน domain III ไม่สามารถฆ่าลูกน้ำยุงลาย และเซลล์ยุงลาย (S. albopictus C6/36 cells) จากการศึกษานี้สามารถเสนอได้ว่าชิ้นส่วน domain III ของโปรตีนชนิด Cry4Ba น่าจะมีบทบาทในการรักษาเสถียรภาพของโครงสร้างโปรตีน การจับ กับเยื่อหุ้มเซลล์จำลองและโปรตีนตัวรับจำเพาะ

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Chanan Angsuthanasombat

Role: Thesis Advisors

Created: 2007

Modified: 2553-06-23

Issued: 2010-06-08

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: TH P832f 2007

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Molecular Genetics and Genetic Engineering

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4537105.pdf	4.22 MB	34	2026-05-26 18:16:01

ใช้เวลา

0.297562 วินาที