Comparison of the sensitivities of PCR metohds for genotyping of Giardia duodenalis

การเปรียบเทียบความไวของ PCR วิธีต่าง ๆ ในการแยกสายพันธุ์ของเชื้อจิอาร์เดียดูโอดีนาลิส

Name: Kwannan Nantavisai

LCSH: Giardia duodenalis

MeSH: Fluorescent Antibody Technique, Direct

MeSH: Polymerase Chain Reaction

Abstract: Giardia duodenalis is a unicellular organism that infects the small intestine of humans and a variety of other mammalian hosts. The detection of this organism is usually based on microscopic methods following the application of fecal concentration techniques. The development of immunofluorescence microscopy has generally improved the sensitivity of detecting and quantitating fecal Giardia cysts compared to conventional microscopy. However, neither traditional microscopic methods nor immunofluorescence microscopy can discriminate between morphological identical, or similar, organisms that are genetically different. Thus, molecular methods, particularly PCR-based techniques, have been developed as diagnostic methods to solve this problem. To date, several techniques for DNA extraction and PCR amplification have been published; however, comparisons of their sensitivities have not been conducted. An evaluation of the sensitivities of three DNA extraction methods (i.e. FTA filter paper, QIAamp stool mini kit, and conventional phenol/chloroform method) by using fecal specimens with known concentration of G. duodenalis cysts was performed. FTA filter paper was the most effective method, which could detect G. duodenalis in fecal specimens with the concentration of at least 0.6 cysts/PCR reaction mixture. The sensitivities of 5 previously described PCR protocols, using five different genotyping primer sets, were also compared in Giardia DNA derived from both trophozoites and cysts. The results showed that RH11/RH4, GiarF/GiarR primer set that amplified SSU-rRNA gene of this organism was the most sensitive primer. A blind diagnostic test to compare PCR and immunofluorescent assay for the detection of G. duodenalis in stool specimens was also conducted. FTA filter paper for DNA extraction together with the PCR method using the primer set RH11/RH4, GiarF/GiarR primer set showed 97.30% sensitivity and 100% specificity for the detection of G. duodenalis in stool specimens, while the immunofluorescent assay gave a sensitivity of 91.90% and a specificity of 100%. There were no statistically significant differences (p=0.61) between these two methods.

Abstract: Giardia duodenalis เป็นโปรโตซัวเซลล์เดียวที่อาศัยอยู่ภายในลำไส้เล็กของมนุษย์และสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมหลายชนิด การวินิจฉัยโรคซึ่งเกิดจากเชื้อชนิดนี้โดยทั่วไปยังใช้วิธีการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ การพัฒนากล้องจุลทรรศน์ชนิดฟลูออเรสเซ้นเพื่อนำมาใช้สำหรับการวินิจฉัยโรคสามารถเพิ่มความไวในการตรวจวินิจฉัยได้ อย่างไรก็ตามทั้งสองวิธีดังกล่าวไม่สามารถใช้จำแนกสายพันธุ์ของเชื้อชนิดนี้ได้ จึงมีการพัฒนาวิธีการเพิ่มสารพันธุกรรมขึ้นเพื่อแก้ปัญหาดังกล่าว แม้ว่าวิธีการเพิ่มสารพันธุกรรมและวิธีการสกัดสารพันธุกรรมหลายวิธีได้ถูกพัฒนาขึ้นสำหรับการตรวจหาเชื้อชนิดนี้แต่ยังไม่เคยมีการศึกษาเปรียบเทียบความไวของวิธีการเหล่านี้ งานวิจัยนี้มีจุดประสงค์เพื่อเปรียบเทียบความไวของวิธีสกัดสารพันธุกรรม 3 วิธี ได้แก่ ชุดสกัดสารพันธุกรรมชนิดสำเร็จรูป 2 ชนิด คือ FTA assay และ QIAamp stool mini kit และวิธีสกัดสารพันธุกรรมแบบดั้งเดิมด้วยสารฟีนอลคลอโรฟอร์ม จากการทดลองพบว่ามีวิธี FTA assay มีความไวที่สุด โดยสามารถสกัดสารพันธุกรรมของเชื้อในตัวอย่างอุจจาระได้ถึงแม้ว่ามีเชื้อเพียง 0.6 cysts เท่านั้น เนื่องจากความไวสูงของวิธี FTA assay ดังนั้นวิธีนี้จึงถูกนำมาใช้ในการประเมินความไวของของไพรเมอร์ในการสังเคราะห์สารพันธุกรรมของเชื้อในตัวอย่างอุจจาระและเชื้อจากการเพาะเลี้ยงในห้องทดลองพบว่าไพรเมอร์ชุด RH11/RH4, GiarF/GiarR ซึ่งใช้จำเพาะกับ SSU gene เป็นไพรเมอร์ที่ให้ผลดีที่สุด และยังสามารถนำไปใช้วิเคราะห์หาสายพันธุ์ของเชื้อได้อีกด้วย นอกจากนี้ในการศึกษาครั้งนี้ได้เลือกวิธีการสกัดสารพันธุกรรมและไพรเมอร์ที่มีความไวสูง เพื่อนำมาใช้ในการเปรียบเทียบความไวและความจำเพาะระหว่างวิธีการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมและวิธีกล้องจุลทรรศน์ชนิดฟลูออเรสเซ้น จากการศึกษาพบว่าวิธีการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมมีความไวสูงถึง 97.30% และมีความจำเพาะ 100% ในขณะที่วิธีกล้องจุลทรรศน์ชนิด ฟลูออเรสเซ้นมีความไว 91.9% และมีความจำเพาะ 100% เช่นเดียวกันซึ่งทั้งสองวิธีไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p=0.61)

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Peerapan Tan-ariya

Role: Thesis Advisors

Created: 2006

Modified: 2553-06-24

Issued: 2010-06-07

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740474802

CallNumber: TH K98c 2006

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Microbiology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4736167.pdf	1.07 MB	20	2018-05-29 11:26:13

ใช้เวลา

0.301855 วินาที