Inactivation and mutation analysis of ribosomal RNA ‪(rRNA)‬ operon‪(s)‬ in Synechococcus PCC7942 and Thermus thermophilus

การยับยั้งการทำงานและการวิเคราะห์ด้วยการกลายพันธุ์ของ ribosomal RNA ‪(rRNA)‬ operon‪(s)‬ ใน Synechococcus PCC9742 และ Thermus thermophilus

Name: Tanakarn Monshupanee

LCSH: Genetic engineering -- Methodology

MeSH: Capreomycin Sulfate

MeSH: Genes, rRNA

MeSH: Synechococcus

MeSH: Thermus thermophilus

Abstract: The presence of more than one copy of rRNA operons in phototrophic cyanobacterium Synechococcus PCC7942 and thermophlic bacterium Thermus thermophilus has been an obstacle to analyzing mutated rRNA. In this thesis, in vivo systems for analyzing homogeneous mutated rRNA in Synechococcus and T. thermophilus were developed. Synechococcus has a multicopy chromosome, with each copy containing two rRNA operons (rrnA and rrnB), each operon harbors [16S rRNA-tRNAIle-tRNAAla-23S rRNA-5S rRNA] genes. The chromosomal rrn operons of Synechococcus were sequentially inactivated using deletion-insertion mutagenesis; a final strain was obtained with all the chromosomal rrn operons inactivated but carrying a replaceable multicopy plasmid encoding a single rrn operon. The lag time required for initiating cell growth after dark/light shift of mutant strains with rrnA or rrnB inactivated was increased 50% over that of the wild-type strain. The doubling time of strains with inactivated rrnA operon, but not strains with inactivated rrnB operon, were significantly longer than that of the wild-type strain. Plasmids containing a mutation at position 2588 of 23S rRNA were transferred into the strain with all the chromosomal rrn operons inactivated to replace the plasmid containing wild-type rrn operon. The results revealed that a strain in which all the cellular 23S rRNA contained the mutation C2588A was temperature sensitive at 16 °C and 45 °C. However, attempts to select for strains with all cellular 23S rRNA containing C2588G/T mutations were unsuccessful. Thus, the C2588G/T mutations may be lethal to the cells. Position C2588 is equivalent to C2611 of the peptidyltransferase centre in domain V of Escherichia coli 23S rRNA. T. Thermophilus has one chromosome with two copies of rRNA operons (copy A and copy B), each containing [23S rRNA-5S rRNA-tRNAGly] genes. The T. Thermophilus strain with copy B operon inactivated was constructed using deletion-insertion mutagenesis. The resulting strain, harboring only one functional copy A, was used to isolate spontaneous mutants resistant to Capreomycin antibiotic. Analysis of chromosomal DNA of these mutants using genetic-recombination mapping and DNA sequencing revealed that each mutation of 23S rRNA, at positions: A1913T, T1915G or ΔT1915 is responsible for Capreomycin resistance phenotype. These three mutations also conferred cross resistance to Viomycin and some aminoglycoside antibiotics. The A1913 and T1915 located at helix 69 of 23S rRNA, which is involved in association between 30S and 50S ribosome subunits. The in vivo systems for expressing homogeneous mutated rRNA in Synechococcus and T. thermophilus described in this thesis, provide potential to study rRNA structure-function relationships in phototrophs and thermophiles

Abstract: การมี rRNA operons มากกว่าหนึ่งชุดในแบคทีเรียสังเคราะห์แสง Synechococcus PCC7942 และแบคทีเรียทน ร้อน Thermus thermophilus เป็นอุปสรรคต่อการวิเคราะห์ rRNA กลายพันธุ์ วิทยานิพนธ์นี้ได้พัฒนาระบบเซลล์ สำหรับการวิเคราะห์ rRNA กลายพันธุ์แบบเดียวกัน ใน Synechococcus และ T. thermophilus Synechococcus มีโครโมโซมหลายชุด แต่ละชุดมีสอง rRNA operons (rrnA และ rrnB) แต่ละ operon มี ยีน [16S rRNA-tRNAIle-tRNAAla-23S rRNA-5SrRNA] ได้ทำการยับยั้งการทำงานของ rrn operons ทั้งสองบนโครโมโซม ตามลำดับโดยวิธี deletion-insertion mutagenesis จนได้สายพันธุ์สุดท้ายซึ่ง rrn operons บนโครโมโซมทั้งหมดถูก ยับยั้งการทำงาน แต่มี rrn operon บนพลาสมิดซึ่งสามารถถูกแทนที่ได้ด้วยพลาสมิดอื่น สายพันธุ์ที่มี rrnA หรือ rrnB ถูกยับยั้งการทำงานมี lag time ซึ่งใช้ปรับตัวเริ่มการเจริญเติบโตจากที่มืดไปสู่ที่มีแสงเพิ่มขึ้น 50% เมื่อเปรียบเทียบกับ lag time ของ wide type สายพันธุ์ที่ rrnA ถูกยับยั้ง จะมี doubling time นานขึ้นกว่าของ wide type อย่างมีนัยสำคัญ แต่ ปรากฏการณ์ดังกล่าวไม่พบในสายพันธุ์ซึ่ง rrnB ถูกยับยั้ง พลาสมิดที่มีการกลายพันธุ์ของ 23S rRNA ที่ตำแหน่ง 2588 ได้เข้าไปแทนที่พลาสมิดที่มี wild-type rrn ในสายพันธุ์ซึ่ง rrn บนโครโมโซมทั้งหมดถูกยับยั้ง ผลการทดลองพบว่า สายพันธุ์ที่สร้าง 23S rRNA กลายพันธุ์แบบเดียวกันที่ C2588A มีความไวต่ออุณหภูมิที่ 16 oC และ 45 oC อย่างไรก็ตาม ไม่ประสบความสำเร็จในการคัดเลือกสายพันธุ์ ซึ่งสร้าง 23S rRNA กลายพันธุ์แบบเดียวกันที่ C2588G/T ดังนั้นการ กลายพันธุ์ C2588G/T อาจมีผลให้เซลล์ตาย ตำแหน่ง C2588 เทียบเท่ากับ C2611 ซึ่งอยู่ที่ศูนย์กลางของ peptidyltransferaseใน domain V บน 23S rRNA ของEscherichai coli T. thermophilus มีโครโมโซมเดียวแต่มีสอง rRNA operons (copy A และ copy B) แต่ละ operon มียีน [23S rRNA-5S rRNA-tRNAGly] ได้สร้างสายพันธุ์ซึ่งมีแต่ copy A ส่วน copy B ถูกยับยั้งโดยวิธี deletion-insertion mutagenesis เพื่อใช้คัดเลือกการกลายพันธุ์ที่เกิดขึ้นเองและนำไปสู่การดื้อต่อยาปฏิชีวนะ Capreomycin เมื่อวิเคราะห์ การกลายพันธุ์บน chromosomal DNA ด้วยวิธี genetic-recombination mapping และ DNA sequencing พบว่ามีการ กลายพันธุ์ที่ A1913T, T1915 หรือ ΔT1915 บน 23S rRNA ซึ่งการกลายพันธุ์ที่ตำแหน่งใดตำแหน่งหนึ่งดังกล่าว นำไปสู่การดื้อต่อยาปฏิชีวนะ Capreomycin การกลายพันธุ์นี้ยังก่อให้เกิดการดื้อต่อยาปฏิชีวนะ Viomycin และ aminoglycoside บางชนิด ตำแหน่ง A1913 และ T1915 ซึ่งอยู่ใน helix 69 ของ 23S rRNA เกี่ยวข้องกับการรวมตัวของ 30S และ 50S ribosome subunits วิทยานิพนธ์นี้ได้พัฒนาระบบเซลล์ซึ่งสร้าง rRNA กลายพันธุ์ที่เป็นแบบเดียวกัน สามารถศึกษาความสัมพันธ์ ระหว่างโครงสร้างและหน้าที่การทำงานของ rRNA ใน phototrophs และ thermophiles

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Wipa Chungjatupornchai

Role: Thesis Advisors

Created: 2006

Modified: 2553-06-23

Issued: 2010-06-05

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740478433

CallNumber: TH T161i 2006

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Molecular Genetics and Genetic Engineering

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4436420.pdf	4.19 MB	13	2020-05-13 01:59:12

ใช้เวลา

-0.606508 วินาที