Rapid detection of rotavirus in shellfish by Nested Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction

การตรวจไวรัสโรตาในหอยอย่างรวดเร็วโดยวิธี Nested Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction

Name: Khurawan Kumkrong

MeSH: Polymerase Chain Reaction -- methods

MeSH: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

MeSH: Rotavirus

MeSH: Shellfish

MeSH: Virus Diseases -- diagnosis

Abstract: Rotaviruses are well recognized as one of the principal etiologic agents of acute diarrhea illness in human infants and young animals. There have been outbreaks of food-borne gastroenteritis caused by rotaviruses in raw or slightly cooked shellfish. A concentration method and a highly sensitive and specific technique are required to detect the presence of viruses in food samples. This study aimed to develop a method for the concentration of rotavirus and detection by nested reverse transcriptasepolymerase chain reaction. In the seeding experiment, rotavirus was concentrated from seeded oyster samples by means of acid adsorption, elution with 2.9% tryptose phosphate broth in 6% glycine pH 9.0, two precipitations by polyethylene glycol, and chloroform extraction. The RNA was extracted from the rotavirus and then detected using nested reverse transcriptase-polymerase chain reaction. The detection limit was 8 X 102 infectious forming units per gram, 1.43 X 102 per milliliter, and 0.7 per assay. A DNA band appeared at the 346 base pair fragment. No cross-reactivity was found in the presence of hepatitis A virus (≤ 3.36 X 103 radioimmunofocus assay units/ml) and poliovirus (≤ 106; 50% tissue culture infective doses/ml). A total of 100 oyster samples (Crassostrea belcheri) were collected from several markets in Bangkok and Patum Thani Province. The samples were concentrated and RNA was extracted. The RNA extract was then tested for the presence of rotavirus RNA using the nested reverse transcriptase-polymerase chain reaction. All oyster samples were found to be negative. The oyster samples were then tested for contamination with fecal coliforms, including E. coli, using the multiple tube fermentation method. Ninety three were found to be contaminated with both fecal coliforms and E. coli, while one was only contaminated with fecal coliforms. Fifty eight samples had fecal coliform contamination levels higher than the government standard for raw shellfish (most probable number of <20/g), ranging between 21 and 540 per gram. It is notable that, of the 42 oyster samples below the acceptable level for fecal coliforms, 35 had high E. coli most probable number values in the range of 1.8 to 17 per gram. The present study indicated that the combination of the virus concentration method and nested reverse transcriptase-polymerase chain reaction method was efficient in the detection of rotavirus in oyster samples. The oyster samples collected from several markets were safe for rotavirus. However, most oyster samples from local markets in Bangkok and Patum Thani Province were contaminated with fecal coliforms and E. coli. This could indicate a health risk for gastroenteritis illness for consumers who ate raw or only slightly cooked oysters.

Abstract: ไวรัสโรตาเป็นสาเหตุสำคัญก่อโรคอุจจาระร่วงเฉียบพลันในเด็กเล็ก และสัตว์ที่ยังเยาว์ มีรายงานการ ระบาดของโรคทางเดินอาหารอักเสบ สาเหตุจากไวรัสโรตา โดยมีอาหารเป็นสื่อ และตรวจพบไวรัสโรตาในหอย ดิบพร้อมบริโภค เนื่องจากในตัวอย่างอาหารมีไวรัสอยู่จำนวนน้อย จึงต้องอาศัยวิธีการเตรียมตัวอย่างอาหาร ให้ เข้มข้น และวิธีตรวจที่มีความไวและความจำเพาะสูง การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อพัฒนาวิธีทำให้ไวรัสโรตาใน ตัวอย่างหอยนางรมเข้มข้นขึ้น และตรวจด้วยวิธี nested reverse transcriptase-polymerase chain reaction ได้ทำการ ทดลองใส่เชื้อไวรัสโรตาในหอยนางรม ทำให้เข้มข้นด้วยวิธี acid adsorption และ ชะไวรัสด้วย 2.9% tryptose phosphate broth ใน 6% glycine pH 9.0, ตกตะกอนไวรัสโดยใช้ polyethylene glycol 2 ครั้ง, และสกัดด้วย คลอโรฟอร์ม เมื่อสกัดอาร์เอนเอออกจากไวรัส และตรวจด้วยวิธี nested reverse transcriptase-polymerase chain reaction พบว่าสามารถตรวจไวรัสโรตา 8 X 102 infectious forming units/g, 1.43 X 102 ต่อตัวอย่างหอยนางรม เข้มข้น 1 ml หรือเท่ากับ 0.7 infectious forming units/assay ปรากฎแถบดีเอนเอ ที่ 346 base pair ไม่พบปฎิกิริยา ข้ามกับไวรัสตับอักเสบ เอ ที่ความเข้มข้น ≤ 3.36 X 103 radioimmunofocus assay units/ml และไวรัสโปลิโอที่ ความเข้มข้น ≤ 106; 50% tissue culture infective doses/ml เก็บตัวอย่างหอยนางรม (Crassostrea belcheri) จำนวน 100 ตัวอย่าง จากตลาดหลายแห่งในกรุงเทพมหานคร และจังหวัดปทุมธานี ทำให้ไวรัสเข้มข้นแยกสกัดอาร์เอนเอ ของไวรัส และตรวจโดยใช้วิธี nested reverse transcriptase-polymerase chain reaction ผลการทดลองในตัวอย่าง หอยนางรมทั้งหมดไม่พบอาร์เอนเอของไวรัสโรตา ทำการตรวจแบคทีเรียตัวชี้วัดการปนเปื้อนอุจจาระ (fecal coliforms และ E. coli) ในตัวอย่างหอยนางรม โดยใช้วิธี multiple tube fermentation method พบว่าตัวอย่าง หอยนางรม ร้อยละ 94 ปนเปื้อนด้วย fecal coliforms ในจำนวนนี้มี 58 ตัวอย่าง ปนเปื้อนด้วย fecal coliforms เกินค่ามาตรฐานกำหนดของหอยนางรมดิบ (ค่ามาตรฐาน < 20 most probable number/g) อยู่ในช่วง 21-540 ต่อ กรัม และตัวอย่างหอยนางรม ร้อยละ 93 ปนเปื้อนด้วย E. coli อยู่ในช่วง 1.8-240 ต่อกรัม เป็นที่น่าสังเกตว่ามี หอยนางรมจำนวน 35 ตัวอย่าง จาก 42 ตัวอย่าง ซึ่งมีค่า fecal coliforms อยู่ในเกณฑ์มาตรฐาน แต่ปนเปื้อนด้วย E. coli 1.8-17 ต่อตัวอย่างหอยนางรม 1 กรัม การศึกษาครั้งนี้ชี้ให้เห็นว่า วิธีทำให้ไวรัสเข้มข้น และตรวจอาร์เอนเอด้วยวิธี nested reverse transcriptase - polymerase chain reaction มีประสิทธิภาพในการตรวจไวรัสโรตาในตัวอย่างหอยนางรม และหอย นางรมที่เก็บจากตลาดมีความปลอดภัยจากไวรัสโรตาอย่างไรก็ตามหอยนางรมจากตลาดหลายแห่งใน กรุงเทพมหานคร และจังหวัดปทุมธานีส่วนใหญ่มี fecal coliforms และ E. coli ปนเปื้อน ผู้บริโภคหอยนางรม แบบดิบ หรือสุกๆ ดิบๆ จึงอาจมีความเสี่ยงต่อการเกิดโรคในระบบทางเดินอาหาร

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Leera Kittigul

Role: Thesis Advisors

Created: 2004

Modified: 2553-06-23

Issued: 2010-06-05

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740449069

CallNumber: TH K45r 2004

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Infectious Diseases and Epidemiology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4436069.pdf	2.15 MB	14	2025-09-25 09:35:01

ใช้เวลา

0.250345 วินาที