Expression of argonaute protein of penaeus monodon and characterization of its biochemical function

การแสดงออกและการศึกษาคุณลักษณะหน้าที่ทางชีวเคมีของโปรตีน Argonaute ในกุ้งกุลาดำ

Name: Narakorn Khunweeraphong

LCSH: Argonaute protein

LCSH: Penaeus monodon

LCSH: Shrimps -- Virus diseases -- Protection

MeSH: RNA-Induced Silencing Complex

MeSH: RNA Interference

MeSH: RNA, Catalytic

Abstract: Argonaute protein is the core component of RISC (RNA-induced silencing complex) that plays a critical role in post-transcritptional silencing of gene expression resulting in sequence-specific mRNA cleavage (siRNA pathway) or translation suppression (miRNA pathway). This mechanism is known as RNA interference (RNAi) which is responsible for antiviral mechanism in eukaryotes. The understanding of RNAi in shrimp is essential for development of an effective viral defense strategy in the future. Argonaute proteins are defined by the presence of 2 conserved regions, RNAbinding PAZ domain and the endonuclease-like PIWI domains. This study emphasizes the expression of the recombinant Argonaute (Pem-AGO) and PAZ domain proteins of P. monodon and characterizes their biochemical function in the RNAi pathway. Recombinant PAZ domain protein was firstly expressed in Pichia pastoris expression system. However, the recombinant protein could not be observed in either the intracellular or extracellular compartment. Accordingly, the expression system was altered to Escherichia coli (BL21(DE3)pLysS) by utilizing pET-15b as an expression vector to produce the recombinant Pem-AGO and PAZ domain protein as N-terminal hexahistidine fusion-tagged proteins with the molecular weight 108 kDa for Pem- AGO and 19 kDa for PAZ domain protein. The soluble fractions were further purified by Ni2+ column affinity chromatography. The RNA binding activity of the recombinant PAZ domain was investigated by Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) with 32P-labeled ssRNA. By using ssRNA, dsRNA or ssDNA as competitors, the result revealed that the PAZ domain binds preferentially to RNA, either single- or double-stranded, rather than to DNA. The function of Argonaute protein in sequence-specific mRNA cleavage was characterized by mRNA cleavage assay. However, the primary attempt on mRNA cleavage assay to determine the function of Argonaute protein has not been successful. The results implied that Pem-AGO should participate in RNAi pathway as it possesses preferential RNA binding activity of the PAZ domain. Nevertheless, it cannot be concluded at this point whether Pem-AGO functions in the siRNA or miRNA pathway.

Abstract: โปรตีน Argonaute เป็นองค์ประกอบหลักของโมเลกุล RISC ซึ่งทำหน้าที่ควบคุมยีน ทำให้เกิดการ ตัดสาย mRNA แบบจำเพาะใน siRNA pathway หรือการยับยั้งการสร้างโปรตีนใน miRNA pathway กระบวนการนี้เรียกว่า RNA interference (RNAi) ซึ่งมีบทบาทในการป้องกันไวรัสในสิ่งมีชีวิตหลายชนิด การศึกษาความเข้าใจกระบวนการ RNAi ในกุ้งกุลาดำจึงมีประโยชน์ต่อการพัฒนาวิธีป้องกันโรคไวรัสของกุ้งใน อนาคต โปรตีน Argonaute มี 2 บริเวณอนุรักษ์ ได้แก่ บริเวณ PAZ ที่ใช้จับกับ RNA และ บริเวณ PIWI ที่มีโครงสร้างเหมือน endonuclease งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อทำการแสดงออกและวิเคราะห์หน้าที่ของ โปรตีนลูกผสม Argonaute ของกุ้งกุลาดำ (Pem-AGO) และ PAZ domain ในการทดลองนี้ไม่ประสบ ความสำเร็จในการแสดงออกของโปรตีนลูกผสม PAZ domain ในยีสต์ Pichia pastoris ทั้งในรูปของ โปรตีนภายในเซลล์และโปรตีนที่หลั่งออกนอกเซลล์ ด้วยเหตุนี้จึงทำการแสดงออกของโปรตีนใน Escherichia coli สายพันธุ์ BL21(DE3)pLysS แทน โดยใช้พลาสมิด pET-15b เพื่อสร้างโปรตีนลูกผสมของ Pem- AGO และ PAZ domain ในรูปที่เชื่อมต่อกับ histidine ทางปลายอะมิโน โปรตีนลูกผสมที่แสดงออกมาใน รูปที่ละลายน้ำได้ถูกทำให้บริสุทธิ์ก่อนนำไปทดสอบความสามารถในการจับกับ RNA โดยวิธี Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) โดยใช้ RNA สายเดี่ยวที่ทำการติดฉลากด้วยสาร กัมมันตรังสี พบว่าโปรตีน PAZ สามารถจับกับ RNA สายเดี่ยวและสายคู่ได้ดีกว่าการจับกับ DNA ส่วนหน้าที่ ของโปรตีน Argonaute ที่ทดสอบโดยวิธี mRNA cleavage assay เพื่อศึกษาการตัดสาย mRNA แบบ จำเพาะ อย่างไรก็ตามการทดลองเบื้องต้นยังไม่ประสบผลสำเร็จ กล่าวโดยสรุป ผลการทดลองจากงานวิจัยนี้แสดง ให้เห็นว่า Pem-AGO น่าจะมีบทบาทในกระบวนการ RNAi เนื่องจากมี PAZ domain ที่จับกับ RNA อย่างจำเพาะ ซึ่งเป็นคุณลักษณะอย่างหนึ่งของโปรตีน Argonaute ในกระบวนการ RNAi อย่างไรก็ตามยังไม่ สามารถสรุปได้ว่า Pem-AGO ทำหน้าที่ในกระบวนการตัดสาย RNA แบบจำเพาะ (siRNA pathway) หรือ กระบวนการยับยั้งการสร้างโปรตีน (miRNA pathway)

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Apinunt Udomkit

Role: Thesis Advisors

Created: 2006

Modified: 2553-06-24

Issued: 2010-06-05

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740476708

CallNumber: TH N218e 2006

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Molecular Genetics and Genetic Engineering

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4737243.pdf	5.59 MB	29	2026-08-05 18:50:04

ใช้เวลา

0.456395 วินาที