Molecular cloning and expression of the nucleoprotein gene of influenza a virus

การผลิตโปรตีนจากยีนส่วนนิวคลีโอโปรตีนของเชื้อไข้หวัดใหญ่ชนิดเอ

Name: Sirikwan Boonmoh

MeSH: Cloning, Molecular

MeSH: Gene Expression

MeSH: Influenza A virus

MeSH: Nucleoproteins

Abstract: Influenza A virus infection has emerged as one of the major threats to human and animal health. The current outbreak of avian influenza virus of the H5N1 type in animals has the potential to cause new influenza pandemics which may have devastating results. Strategies for preventing and managing the potential outbreaks include the ability to detect the infection, prompt therapy, vaccines, and public health measures. One of the assays for identifying the infection is based on the nucleoprotein (NP) protein and its antibody. The aim of this study is to clone and express the recombinant nucleoprotein of influenza A virus, which is immunogenic and can react with antibodies to NP. The strategy used in this study involved PCR amplification of NP gene from the H5N1 strain of influenza A and cloning into prokaryotic expression vectors. The RNA from avian influenza isolate, A/chicken/Nakorn-Pathom/Thailand/cu-k2/04 (H5N1), was amplified using primers covering the full-length NP gene and it was cloned into pMAL-c2x plasmid and transformed into E. coli TB1. pMAL-c2x expression vector allows the expression of fusion protein of influenza H5N1 NP and maltose binding protein (MBP). It is known that NP protein is insoluble and therefore the MBP tagged fusion protein may improve solubility. However, the recombinant NP-MBP clone did not express the protein after induction with IPTG. Since the attempt to express full-length NP gene was unsuccessful, the NP insert was truncated by removing the potential toxic portion while the immunogenic domain remained intact. Attempts were also made to retransform the recombinant gene into another expression vector, pQE-30, which expresses 6xHis fusion protein at N-terminal. The results showed that the truncated nucleoprotein gene was cloned into pMAL-c2x and transformed into E. coli TG1, and it was cloned into pQE-30 and transformed into E. coli TG1 and M15(pREP4). However, none of the recombinant E.coli expressed the fusion proteins. The incompatibility of codon usage of the NP gene (eukaryotic type) and E. coli host cell (prokaryotic type) was identified as a factor affecting the inability to express the NP protein in E. coli host cells. Nucleoprotein of influenza A virus have many rare codons for the E. coli system. Therefore, a special E. coli host cell, BL21(DE3)-RIL that has rare tRNAs was used as the host cell for protein expression. Truncated recombinant NP gene in pMAL-c2x was transformed into this E. coli strain. After induction, the recombinant E. coli expressed the protein in both soluble and non-soluble fractions. In order to produce higher levels of soluble protein, the temperature for bacterial culture was reduced and the result showed that 20 and 25 degree Celsius was appropriate. The soluble recombinant truncated nucleoprotein was expressed and purified by binding of MBP and amylose resin, and then eluted by maltose. The purified protein was found to be immunogenic and can react with monoclonal antibodies against nucleoproteins of influenza A virus.

Abstract: การติดเชื้อไข้หวัดใหญ่ชนิดเอ เป็นหนึ่งในปัญหารุนแรงต่อคนและสัตว์ การระบาดของเชื้อไข้หวัดนกสายพันธุ์ H5N1ในปัจจุบันในสัตว์ก่อให้เกิดการระบาดครั้งใหม่ขึ้นมา ซึ่งมีผลกระทบอย่างมากในปัจจุบัน วีธีการที่จะป้องกันและควบคุมการระบาดนั้นขึ้นอยู่ที่การตรวจหาการติดเชื้อ การรักษาอย่างทันท่วงที การให้วัคซีนและการติดตามทางระบบสาธารณสุข การตรวจหาการติดเชื้อมีได้หลายวิธีซึ่งรวมถึงการตรวจหาที่ใช้โปรตีนส่วนนิวคลีโอโปรตีน และแอนติบอดีที่จำเพาะต่อนิวคลีโอโปรตีน ดังนั้นในการศึกษาครั้งนี้จึงมีจุดประสงค์ในการสร้าง นิวคลีโอโปรตีนของไวรัสไข้หวัดใหญ่ชนิดเอ ที่สามารถทำปฏิกิริยา กับแอนติบอดีที่จำเพาะต่อนิวคลีโอโปรตีน การผลิต recombinant protein ใช้ pMAL-c2x plasmid ในการตัดต่อยีนทั้งสายของนิวคลีโอโปรตีนเข้าไป เพื่อที่ได้นิวคลีโอโปรตีน ที่มีคุณสมบัติคงเดิมตามธรรมชาติและละลายน้ำได้ โดยอาศัยการรวม maltose binding protein (MBP) ที่สร้างจาก plasmid เข้าไปต่อกับนิวคลีโอโปรตีน ที่ต้องการ โดยเริ่มจากนำเชื้อไข้หวัดนกสายพันธุ์ A/chicken/Nakorn-Pathom/Thailand/cu-k2/2004 (H5N1) RNA มาเพิ่มจำนวนและตัดต่อเข้าสู่ plasmid pMAL-c2x จากนั้นจึงนำเข้าไปในเชื้อ E. coli TB1 จากนั้นจึงกระตุ้นให้เชื้อ TB1 สร้างโปรตีน ผลที่ได้คือเชื้อไม่สามารถผลิตโปรตีนที่ต้องการได้ ดังนั้นจึงทำการลดขนาดของยีนให้สั้นลง เพื่อลดการเป็นพิษต่อเชื้อ E. coli ซึ่งการผลิตโปรตีนได้ใช้ plasmid pMAL-c2x และ pQE-30 ที่สร้าง 6xHistidine ที่รวมกับนิวคลีโอโปรตีน ที่ต้องการ ยีนที่ลดขนาดลงแล้วถูกนำไปตัดต่อเข้า pMAL-c2x และใส่เข้าไปใน E. coli TG1 แล้วตัดต่อเข้า pQE-30 แล้วใส่เข้าไปใน E. coli TG1 และ E.coli M15(pREP4) จากนั้นจึงกระตุ้นให้เชื้อทั้งหมดสร้างโปรตีน ผลที่ได้คือไม่มี recombinant cells ชนิดไหนผลิตโปรตีนออกมาได้เลย ซึ่งการที่โปรตีนไม่สามารถผลิตได้อาจเกิดจากการที่นิวคลีโอโปรตีน มี codon ของกรดอะมิโนที่ไม่เหมาะสมกับ codon ของ E. coli ทำให้เชื้อไม่สามารถผลิตโปรตีนได้ ดังนั้นจึงเปลี่ยนมาใช้เชื้อ recombinant E. coli BL21(DE3)-RIL ที่มีการ express tRNA ที่จำเพาะกับ codon ในยีนนิวคลีโอโปรตีน ยีนนิวคลีโอโปรตีนที่ลดขนาดใน plasmid pMAL-c2x จะถูกนำเข้าไปใส่ใน เชื้อ E. coli BL21(DE3)-RIL และกระตุ้นให้เชื้อสร้างโปรตีนออกมา ผลปรากฏว่าเชื้อสามารถสร้างโปรตีนทั้งในแบบที่ละลายน้ำได้และไม่ละลายน้ำ การทดลองต่อไปจึงหาอุณหภูมิที่เหมาะสมในการสร้างโปรตีนที่ละลายน้ำได้มากขึ้น โดยลดอุณหภูมิลงเพื่อให้เชื้อค่อยๆสร้างโปรตีนออกมา ผลที่ได้คือที่อุณหภูมิ 20 และ 25 องศาเซลเซียส สามารถผลิตโปรตีนที่ละลายน้ำได้ดี จากนั้นจึงนำโปรตีนไปแยกให้บริสุทธิ์ โดยนำส่วน MBP ของโปรตีนไปเกาะกับ amylose resin และ elute ด้วย maltose หลังจากแยกโปรตีนนิวคลีโอโปรตีน ที่บริสุทธิ์แล้ว ต่อมาจึงนำมาทำ immunoblotting ผลที่ได้คือ โปรตีนนั้นสามารถทำปฏิกิริยากับ monoclonal antibody ต่อนิวคลีโอโปรตีน ของเชื้อไข้หวัดใหญ่ชนิด เอ ได้

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Kovit Pattanapanyasat

Role: Thesis Advisors

Created: 2006

Modified: 2553-06-24

Issued: 2010-06-05

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740477526

CallNumber: TH S619m 2006

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Immunology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4536754.pdf	5.8 MB	25	2024-08-07 09:56:46

ใช้เวลา

0.281046 วินาที