Cloning and expression of enzymes from glycosyl hydrolase family ‪(xylanase and neopullulanase)‬ from the sediments of Bor Khlueng hot spring

การโคลนและการแสดงออกของยีนที่สร้างเอนไซม์ไซแลนเนสและนีโอพูลูแลนเนสจากสิ่งมีชีวิต

Name: Viriya Nitteranon

LCSH: Hot springs

LCSH: Pichia pastoris

MeSH: Endo-1,4-beta Xylanases

MeSH: N-Glycosyl Hydrolases

Abstract: Glycosyl hydrolases comprise a huge group of enzymes (xylanases, neopullulanases, amylases, etc.) and are valuable carbohydrate-degrading enzymes in biotechnological industries. In this study, to obtain genes encoding thermostable enzymes that are required for industrial processes, we have turned to directly obtaining the genes from environmental DNA, specifically, the Bor Khlueng hot spring. Consensus primers based on the conserved regions of family 10 xylanases and family 13 glycosyl hydrolases were used to obtain 167 bp and 560 bp PCR fragments of xylanase and neopullulanase genes, respectively. Sequence analysis of the partial xylanase gene exhibited 65% amino acid sequence identities to Thermobacillus xylanilyticus xynA. However, the full-length xylanase gene was not successfully obtained. For neopullulanase, the amino acid sequence analysis of one clone, BK44, showed 54% identity to glycosyl hydrolase family 13 of Deinococcus radiodurans and 51% identity to Geobacillus kaustophilus alpha-cyclodextrinase. This suggested that the obtained partial sequence from Bor Khlueng hot spring encoded a novel enzyme in this family. Using genome walking approaches, the 3’ and 5’-end of the gene were obtained. The result showed that the full-length BK44 had an open reading frame of 1,458 bp encoding 485 amino acid residues and exhibited 54% identity to maltogenic amylase of Thermus sp., and alpha-cyclodextrinase of Geobacillus kaustophilus; and 53% identity to (neo)pullulanase of Thermus thermophilus. This suggested that BK44 belonged to the neopullulanase subfamily. Expression of the full-length BK44 in P. pastoris and E. coli was performed. The expressed protein of approximately 55 kDa was successfully obtained in E. coli. However, its enzymatic activities were not detected.

Abstract: กลุ่มเอนไซม์ย่อยแป้ง (ไซแลนเนส, นีโอพูลูแลนเนส, อะไมเลส ฯลฯ) เป็นเอนไซม์ที่มี ความสำคัญในอุตสาหกรรมเทคโนโลยีชีวภาพ งานวิจัยนี้ได้ทำการโคลนชิ้นส่วนของยีนไซแลน เนสและนีโอพูลูแลนเนสขึ้นมาจากสิ่งมีชีวิตในตัวอย่างดินของน้ำพุร้อน อ. บ่อคลึง จ. ราชบุรีโดย วิธีพีซีอาร์ ชิ้นส่วนของยีนขนาด 167 และ 560 คู่เบสที่ได้เมื่อนำไปเปรียบเทียบกับฐานข้อมูลพบว่า ชิ้นส่วน 167 คู่เบสมีความคล้ายคลึง 65% ในลำดับกรดอะมิโนกับยีน Thermobacillus xylanilyticus xynA ส่วนชิ้น 560 คู่เบส โคลน BK44 มีความคล้ายคลึง 54% ในลำดับกรดอะมิ โนเมื่อเปรียบเทียบกับเอนไซม์ glycosyl hydrolase family 13 ของ Deinococcus radiodurans และ 51% กับเอนไซม์ alpha-cyclodextrinase ของ Geobacillus kaustophilus โดยได้นำลำดับเบสจากชิ้นยีนที่เลือกมาทำการโคลนต่อไปโดยวิธีการ genome walking PCR จากผลการศึกษาพบว่าไม่สามารถโคลนยีนไซแลนเนสทั้งชิ้นได้ ในทางตรงกันข้ามชิ้นส่วนของ ยีนนีโอพูลูแลนเนสถูกโคลนขึ้นโดยได้ open reading frame ที่มีความยาว 1,458 นิวคลีโอไทด์ ซึ่งถอดรหัสให้โปรตีนที่มีความยาว 485 กรดอะมิโน เมื่อเปรียบเทียบในฐานข้อมูลพบว่าโปรตีนมี ความคล้ายคลึง 54% ในลำดับกรดอะมิโนกับเอนไซม์ maltogenic amylase ของ Thermus sp. และ alpha-cyclodextrinase ของ Geobacillus kaustophilus และมีความคล้ายคลึง 53% กับ เอนไซม์ (neo)pullulanase ของ Thermus thermophilus ซึ่งทั้งหมดเป็นเอนไซม์ในกลุ่มนีโอพูลู แลนเนส ผลการศึกษาการแสดงออกของ BK44 ใน P. pastoris และ E. coli พบว่าสามารถผลิต โปรตีนขนาดประมาณ 55 kDa ใน E. coli ได้ อย่างไรก็ตามจากการศึกษาเบื้องต้นพบว่าโปรตีนนี้ ไม่สามารถแสดงคุณสมบัติของเอนไซม์ต่อซับสเตรทที่จำเพาะต่อยีนนีโอพูลูแลนเนส

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Kusol Pootanakit

Role: Thesis Advisors

Created: 2006

Modified: 2553-06-26

Issued: 2010-06-01

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740470106

CallNumber: TH V818c 2006

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Molecular Genetics and Genetic Engineering

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4636864.pdf	2.03 MB	25	2018-06-09 12:07:15

ใช้เวลา

-0.550498 วินาที