Investigation of folding pathway of CYT2Aa2 insecticidal protein from Bacillus thuringiensis

การศึกษาการม้วนพับตัวในโครงสร้างของโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุง Cyt2Aa2 จาก Bacillus thuringiensis

Name: Weerachon Tepanant

LCSH: Bacillus thuringiensis

LCSH: Mosquitoes

Abstract: Cytolytic or Cyt toxin is a class of mosquitocidal toxins which are produced from Bacillus thuringiensis. The Cyt toxins exhibit specific toxicity against mosquito larvae in vivo and broad-spectrum activity against other cells in vitro. In this work, we have studied the folding pathway of Cyt2Aa2 protoxin produced from B. thuringiensis subsp. darmstadiensis. The protein was expressed in E. coli and purified on a chromatographic column. Size exclusion analysis indicated the monomeric form of the native state after purification. Equilibrium unfolding and refolding of the protein were performed by incubating the protein in various concentrations of the chemical denaturant, guanidine hydrochloride (GuHCl). The folding curves showed a three-state folding in both pathways. This suggests that it might be a simple reversed pathway of Native ↔ Intermediate ↔ Unfold. Thermodynamic free energy of the 1st and 2nd transition was estimated to be 5-6 and 11-16 kcal/mol, respectively. Kinetic unfolding data revealed that the 2nd transition was the rate-determining step with a unfolding rate of 5.83x10-10 sec-1. Structural characterization by fluorescence, circular dichroism and ANS binding assay indicated specific characteristics of molten globule structure of the intermediate state. This molten globule might display an important role in molecular folding and toxin function.

Abstract: โปรตีนฆ่าลูกนํ้ายุงชนิด Cytolytic ซึ่งผลิตมาจากแบคทีเรีย Bacillus thuringiensis มี ความจำ เพาะต่อลูกนํ้ายุงและยังออกฤทธิ์ต่อเซลล์อื่นๆในหลอดทดลอง งานวิจัยนี้ได้ทำ การศึกษาการ ม้วนพับตัวในโครงสร้างของโปรตีนฆ่าลูกนํ้ายุง Cyt2Aa2 ในรูปของ protoxin ที่ผลิตจาก Bacillus thuringiensis สายพันธุ์ darmstadiensis โปรตีนได้ถูกผลิตในแบคทีเรีย E. coli และ ทำ ให้บริสุทธิ์ด้วยเทคนิคโครมาโตกราฟี การวิเคราะห์ขนาดโมเลกุลแสดงการเป็นโมเลกุลเดี่ยวหลัง จากการทำ ให้บริสุทธิ์ จากนั้นทำ การศึกษาวิถีการม้วนพับตัวของโครงสร้างใน 2 วิถีคือ วิถีคลายตัว (Unfolding) และวิถีกลับคืนตัว (Refolding) โดยใช้สารละลาย GuHCl พบว่าทั้ง 2 วิถีมีความ คล้ายกันคือมี 3 สภาวะได้แก่ สภาวะปกติ (Native state) สภาวะกลาง (Intermediate state) และ สภาวะเสียสภาพ (Unfolded state) อาจเป็นได้ว่าการม้วนพับตัวทั้ง 2 วิถีสวนทางซึ่งกันและกัน และสามารถเขียนในรูปของปฏิกิริยาได้ดังนี้ สภาวะปกติ ↔ สภาวะกลาง ↔ สภาวะเสียสภาพ โดยใช้พลังงานในการเปลี่ยนจากสภาวะปกติสู่สภาวะกลางเท่ากับ 5-6 กิโลแคลอรีต่อโมล และ สภาวะกลางสู่สภาวะเสียสภาพเท่ากับ 11-16 กิโลแคลอรีต่อโมล การศึกษาทางจลศาสตร์ของวิถี คลายตัวแสดงให้เห็นถึงการเปลี่ยนจากสภาวะกลางสู่สภาวะเสียสภาพดำ เนินไปอย่างช้าๆด้วยอัตรา 5.38x10-10 ต่อวินาที จึงเป็นขั้นกำ หนดปฏิกิริยาของปฏิกิริยาทั้งหมด เมื่อทำ การศึกษาโครงสร้างด้วย เครื่องฟลูออเรสเซนซ์ , CD และ ANS พบว่า สภาวะกลางมีโครงสร้างที่เรียกว่า molten globule โดยสภาวะดังกล่าวอาจมีความสำ คัญทั้งในการม้วนพับตัวและการทำ หน้าที่ของโปรตีน

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Chartchai Krittanai

Role: Thesis Advisors

Created: 2004

Modified: 2553-06-12

Issued: 2010-04-29

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740452671

CallNumber: TH W398i 2004

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Molecular Genetics and Genetic Engineering

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4536676.pdf	3.44 MB	23	2025-01-22 15:37:07

ใช้เวลา

-0.674763 วินาที