Cloning, expression and polyclonal antibodies production against recombinant VP19 envelope and VP26 capsid proteins of white spot syndrome virus ‪(WSSV)‬ in black tiger shrimp ‪(Penaeus monodon)‬

การโคลน การแสดงออกและการผลิตโพลีโคลนอลแอนติบอดีต่อโปรตีนส่วนเปลือก VP19 และโปรตีนแคปซิด VP26 ของไวรัสตัวแดงดวงขาวในกุ้งกุลาดำ

Name: Phiromsak Phattanapaijitkun

LCSH: Penaeus monodon

LCSH: Recombinant Proteins

LCSH: Syndromes in animals

MeSH: Immunohistochemistry

MeSH: Viral proteins

Abstract: White spot syndrome virus (WSSV) is the causative agent of white spot syndrome in black tiger shrimp (P. monodon) cultured worldwide, including Thailand. This virus was first reported in the 1980s, but major epidemics in Thailand were reported in the 1990s. WSSV transmission can occur both horizontally and vertically. Early detection of WSSV in infected P. monodon is an effective way to control WSSV epidemics in shrimp culture. The objective of this study was to produce polyclonal antibodies (PAbs) to detect white spot syndrome virus. Structural gene of envelope protein VP19 was cloned into expression vector (pMAL-C2) and expressed in E. coli (BL21) as a fusion protein, MBP-VP19 with a M.W. of 55.5 kDa. For WSSV capsid protein VP26, fusion protein with 6-histidine tag, 6 x His- VP 26, was used to generate polyclonal antibodies. The bacterial expression system allowed the production of 10 mg of purified recombinant proteins per liter of bacterial culture. Both recombinant proteins were used to immunize Swiss albino mice to produce polyclonal antibody. The WSSV-specific polyclonal antibodies were characterized by Western blot and immunohistochemistry and detected WSSV in both native and denatured forms. The MBP-VP19 and 6xhis-VP 26 proteins obtained from this project are useful for future vaccine development to prevent WSSV infection in shrimp farms. The recombinant protein will be used to produce monoclonal antibodies (MAbs) and used together with previous WSSV VP28 MAb to confirm and increase detection sensitivity in various immunoassays, including a simple immuno-based test kit (strip- test) and ELISA.

Abstract: ไวรัสตัวแดงดวงขาว (WSSV) เป็นสาเหตุหลักของโรคตัวแดงดวงขาวในกุ้งกุลาดำ (P. monodon) ซึ่งพบการแพร่กระจายของโรคดังกล่าวในฟาร์มเพาะเลี้ยงกุ้งทั่วโลก ไวรัสชนิดนี้ถูกค้นพบในปี 1980 และพบ การแพร่ระบาดอย่างรุนแรงในประเทศไทยในปี 1990 โดยสามารถติดต่อได้หลายช่องทางทั้งจากพ่อแม่พันธุ์ และ สัตว์ที่ติดเชื้อสู่กุ้งโดยตรง การวินิจฉัยการติดเชื้อไวรัสตัวแดงดวงขาวในช่วงเริ่มแรกของการเพาะเลี้ยงเป็น วิธีการป้องกันการแพร่ระบาดของไวรัสชนิดนี้อย่างได้ผล การศึกษานี้ได้ทำการเพิ่มปริมาณยีนโครงสร้างของ โปรตีนส่วนเปลือก (VP19) ของไวรัสตัวแดงดวงขาวโดยนำมาโคลนเข้าสู่ expression vector pMALC2 และนำเข้าสู่ E. coli สายพันธุ์ BL21 และสามารถสร้างโปรตีน MBP-VP19 ขนาด 55.5 kDa สำหรับยีนของโปรตีนส่วนแคปซิด (VP26) ของไวรัสชนิดนี้ที่อยู่ในรูปของ 6xHis-VP26 ได้ถูกนำมาใช้ผลิต โพลีโคลนอลแอนติบอดีเช่นกัน การเตรียม recombinant protein โดยอาศัยแบคทีเรีย E. coli สามารถผลิต โปรตีนปริมาณ 10 mg / l โปรตีนทั้งสองนี้เมื่อนำมาทำให้บริสุทธิ์ด้วยการตัดและสกัดโปรตีนจากแถบของ SDS-PAGE พบว่ามีความบริสุทธิ์สูง ซึ่งเมื่อนำไปฉีดให้หนูขาวสำหรับการผลิตโพลีโคลนอล แอนติบอดีได้ โดยทำการตรวจสอบแอนติบอดีที่จำเพาะต่อโปรตีนของไวรัสด้วยวิธี Western blot และ immunohistochemistry โดยโพลีโคลนอลแอนติบอดีที่ได้นี้สามารถตรวจหาเชื้อไวรัสตัวแดงดวงขาวทั้งใน รูปธรรมชาติและรูปที่เสียสภาพ นอกจากนี้ยังคาดว่าจะสามารถใช้ MBP-VP19 และ 6xHis-VP 26 ที่ผลิต ได้ไปทดสอบความเป็นวัคซีนในการป้องกันการติดเชื้อไวรัสตัวแดงดวงขาว และในอนาคตสามารถนำ recombinant proteinsไปผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดี ที่เพิ่มความไวในการตรวจสอบไวรัส ควบคู่กับ โมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อโปรตีนส่วน VP28 ที่มีอยู่แล้วโดยใช้วิธีทางอิมมิวโนวิทยาที่หลากหลายเช่น strip test หรือ ELISA ได้

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Nitaya Thammapalerd

Role: Thesis Advisors

Created: 2005

Modified: 2553-04-28

Issued: 2010-04-27

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740461026

CallNumber: TH P576c 2005

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Tropical Medicine

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4537238.pdf	1.9 MB	16	2019-12-13 11:17:13

ใช้เวลา

0.243249 วินาที