Crystallization of 2-Methyl-3-Hydroxypyridine-5-Carboxylic acid oxygenase from soil bacterium Pseudomonas SP. MA-1

การตกผลึกของเอนไซม์ 2-เมทธิล-3-ไฮดรอกซีไพริดีน-5-คาร์บอกซีลิก แอซิด ออกซีจีเนสจากเชื้อแบคทีเรียในดิน Pseudomonas SP. MA-1

Name: Worrapoj Oonanant

LCSH: Aromaticity (Chemistry)

LCSH: Aromatic fluorine compounds

LCSH: Crystallization

LCSH: Oxygenases

Abstract: 2-Methyl-3-hydroxypyridine-5-carboxylic acid (MHPC) oxygenase (MHPCO; EC 1.14.12.4) is a flavin-containing enzyme involved in the degradation of vitamin B6 (pyridoxine) by the soil bacterium, Pseudomonas sp. MA-1. MHPCO catalyzes the conversion of its aromatic substrate, MHPC, yielding an aliphatic compound α-(Nacetylaminomethylene)- succinic acid (AAMS). The reaction occurs via hydroxylation reaction and subsequently ring-cleavage reaction. Previous studies have shown that one atom of an atmospheric oxygen molecule is incorporated into the aromatic substrate via electrophilic aromatic substitution mechanism. Another oxygen atom is derived from water molecule. In addition, a metal ion cofactor usually needed for dioxygenase enzymes, is not required in the ring cleavage reaction. Instead, only a flavin adenine dinucleotide cofactor is employed in the aromatic ring cleavage, making it a unique reaction among the group of aromatic flavoprotein hydroxylases. Therefore, availability of atomic resolution structures of MHPCO would provide key insights into the mechanism of this intriguing reaction. In this work, the microbatch and hanging-drop vapor diffusion techniques were applied to obtain crystals of MHPCO complexes: one is a binary complex with its substrate, MHPC, and the other is a flavin complex. The enzyme-substrate complex crystals were crystallized in monoclinic C2 and orthorhombic C222 space groups. The C2 crystal form contains two molecules per asymmetric unit with corresponding VM of 2.6 Å3/Da and 52.7% solvent content. The latter crystal form has four molecules per asymmetric unit with corresponding VM of 2.7 Å3/Da and 53.4% solvent content. These two crystals diffracted X-rays to resolution of 2.5 Å and 2.3 Å, respectively. In addition the flavin complex diffracted X-rays to 2.25 Å resolution. The crystal belonged to the triclinic P1 space group with four molecules per unit cell corresponding to VM of 3.2 Å3/Da and 61.2% solvent content

Abstract: 2-Methyl-3-hydroxypyridine-5-carboxylic acid (MHPC) oxygenase (MHPCO) เป็น เอนไซม์ที่มี FAD (flavin adenine dinucleotide) เป็นโคเอนไซม์ และเกี่ยวข้องกับการสลายตัวของ วิตามินบี 6 ที่อยู่ในดินโดยเชื้อแบคทีเรีย Pseudomonas sp. MA-1 เอนไซม์ MHPCO ทำหน้าที่เร่ง ปฏิกิริยาการเปลี่ยนสารตั้งต้น MHPC ซึ่งเป็นสารอะโรมาติกตัวสุดท้ายที่อยู่ในขบวนการย่อยสลายวิตามิน บี 6 ให้เป็นสารอะลิฟาติก α-(N-acetylaminomethylene)-succinic acid (AAMS) โดยการเติมหมู่ ไฮดรอกซิลเข้าไปในโมเลกุลซึ่งจะทำให้เกิดการสลายพันธะเคมีของสารอะโรมาติก โดยปรกติการสลาย พันธะเคมีของสารอะโรมาติกโดยเอนไซม์ในกลุ่ม dioxygenases จะต้องการไอออนของธาตุโลหะเป็น โคแฟคเตอร์ช่วยในการเกิดปฏิกิริยา แต่ในเอนไซม์นี้ต้องการเฉพาะโมเลกุลของ FAD เป็นโคแฟคเตอร์ ปฏิกิริยานี้เป็นปฏิกิริยาเดียวที่พบอยู่ในกลุ่มของเอนไซม์ aromatic flavoprotein hydroxylase เพราะฉะนั้นการมีโครงสร้างสามมิติของเอนไซม์จะช่วยในการเข้าใจกลไกปฏิกิริยาที่น่าสนใจนี้มากขึ้นใน ระดับโมเลกุล ดังนั้นการตกผลึกโดยวิธี microbatch และ hanging-drop vapor diffusion จึงถูกนำมาใช้ เพื่อนำไปสู่การหาโครงสร้างสามมิติของเอนไซม์ต่อไป ในการวิจัยนี้สามารถตกผลึกเชิงซ้อนของ MHPCO กับสารตั้งต้นได้สองแบบ และสามารถหักเหของแสงเอกซ์เรย์ได้ความละเอียดถึง 2.5 Å และ 2.3 Å โดยมีสมมาตรโมเลกุลเป็น monoclinic C2 และ orthorhombic C222 โดยที่มีโปรตีน 2 โมเลกุล และ 4 โมเลกุล ในหน่วยอสมมาตรตามลำดับ ซึ่งสอดคล้องกับค่าสัมประสิทธิ์ของ Matthews คือ 2.6 และ 2.7 Å3/Da และปริมาณน้ำในผลึกประมาณ 52.7% และ 53.4% ตามลำดับ สำหรับผลึกเชิงซ้อนกับ FAD สามารถตกผลึกได้และทำการวัดการหักเหของแสงเอกซ์เรย์ได้ความละเอียดถึง 2.25 Å มีสมมาตรโมเลกุล เป็นแบบ triclinic P1 และมีโปรตีน 4 โมเลกุลใน 1 หน่วยเซลล์ ที่ค่าสัมประสิทธิ์ของ Matthews เท่ากับ 3.2 Å3/Da และมีปริมาณน้ำในผลึกประมาณ 61.2%

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Jirundon Yuvaniyama

Role: Thesis Advisors

Created: 2005

Modified: 2553-04-23

Issued: 2010-04-05

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740458947

CallNumber: TH W929c 2005

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Biochemistry

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4436747.pdf	1.13 MB	17	2022-07-09 22:02:15

ใช้เวลา

0.458848 วินาที