Metal-supporting polymer for superoxide dismutase mimics and construction of metal-binding tag for protein purification

การผลิตโพลิเมอร์ที่แสดงคุณสมบัติเป็นซุปเปอร์ออกไซด์ ดิสมิวเทสและการสร้างสายเปปไทด์ที่มีคุณสมบัติในการจับจำเพาะกับโลหะเพื่อประยุกต์ใช้ในการทำให้โปรตีนบริสุทธิ์

Name: Theeraphon Piacham

MeSH: Antioxidants

MeSH: Green Fluorescent Protein

MeSH: Polymerization

MeSH: Superoxide Dismutase

Abstract: A Polymer-supported manganese catalyst possessing superoxide dismutase (SOD) activity was synthesized. Matrices consisting of either 4-vinylimidazole (4V) or 1- vinylimidazole (1V) in combination with methacrylic acid (MAA), which were expected to provide avidity to Mn (II) similar to that of the combination of histidine and aspartic acid residues at an active site of SOD, were selected as functional monomers to form a coordination sphere with template metal in a cross-linked polymer. All these matrices were prepared to form polymers through free radical polymerization, using excess amounts of the cross-linking monomer, ethyleneglycol dimethacrylate (EDMA). Mimicing the SOD activity of the polymers was assayed by measuring the inhibition of the photoreduction of nitro blue tetrazolium (NBT). It was anticipated that this catalytic activity would generate from the coordination between a metal center and a complex of three imidazole and one carboxyl groups as in the case of the native enzyme. Surprisingly, the polymer Mn-P1VMAA exhibited much higher activity than did the Mn-P4VMAA. Omitting one of the functional monomers (1V or MAA) resulted in a decrease in SOD activity. These findings strongly support a high potential for the application of the catalytic metal based-imprinted polymer for therapeutic use in the future. The metal-binding tag was applied as a powerful approach for protein purification. The tagger was inserted into the protein of interest at the gene level. Based on the concept that polyhistidine bind tightly with a number of transition metals including Cu2+, Ni2+, Zn2+ and Co2+, the hexahistidine-tagged GFPuv generated from the gene fusion technique here could be purified with Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) charged with zinc ions. Zinc ions rather than copper or nickel ions, were chosen as a linker on account of the very low adsorptivity of the native GFPuv. Although the purification fold of the H6GFP was not greater than that of the native GFPuv, the H6GFPuv was highly pure and the purified protein could easily be obtained in a one-step purification process. Furthermore, an enterokinase cleavage site (DDDDK) could also be inserted to allow for the removal of the hexahistidine sequence after purification in such a way that the fusion partner might interfere or disturb the properties of the native protein. However, neither the metal-binding region nor the enterokinase cleavage site affected either the fluorescent emission or the capacity to bind with the protease of the chimeric protease-binding GFPuv. These findings clearly indicate that the metal-binding tag could simply be fused to assist protein purification and the purified chimeric protease-binding GFPuv can directly be applied as a potential tool for protease detection in the future

Abstract: โพลิเมอร์ที่จับกับโลหะแมงกานีสและแสดงคุณสมบัติเป็นซุปเปอร์ออกไซด์ ดิสมิวเทส ได้ถูกสังเคราะห์ขึ้น โดยใช้ฟังก์ชันนัล โมโนเมอร์ 4-vinylimidazole หรือ 1-vinylimidazole และ methacrylic acid เป็นตัวจับแมงกานีส ซึ่งฟังก์ชัน นัลโมโนเมอร์เหล่านี้มีคุณสมบัติคล้ายกับหมู่ฟังชันก์ของกรดอะมิโน histidine และ aspartic acid ที่จับอยู่โดยรอบโลหะ ของเอนไซม์ซุปเปอร์ออกไซด์ ดิสมิวเทส โพลิเมอร์นี้ถูกเตรียมโดยวิธี free radical polymerization โดยใช้โมโนเมอร์ตัว เชื่อมคือ ethylene glycol dimethacrylate โพลิเมอร์ที่มีคุณสมบัติเป็นซุปเปอร์ออกไซด์ ดิสมิวเทสถูกนำมาทดสอบเพื่อ วิเคราะห์หาคุณสมบัติการเร่งปฏิกิริยา โดยใช้วิธี Nitro blue tetrazolium based assay จากผลการทดลองพบว่า คุณ สมบัติการเร่งปฏิกิริยาของโพลิเมอร์เหล่านี้เกิดมาจากการจับกันระหว่างโลหะกับฟังก์ชันนัลโมโนเมอร์ เป็นที่น่าสนใจว่าโพลิเมอร์ที่ เกิดจากการจับกันระหว่างแมงกานีสและฟังก์ชันนัลโมโนเมอร์ 1-vinylimidazole และ methacrylic acid ให้ค่าการ เร่งปฏิกิริยามากกว่าโพลิเมอร์ที่เกิดจากการจับกันระหว่างแมงกานีสและฟังก์ชันนัลโมโนเมอร์ 4-vinylimidazole และ methacrylic acid นอกจากนั้นยังพบว่าฟังก์ชันนัลโมโนเมอร์ทั้งสองตัวคือ 1-vinylimidazole และ methacrylic acid มีบทบาทที่สำคัญอย่างยิ่งต่อการเร่งปฎิกิริยาของโพลิเมอร์เหล่านี้ จากการศึกษาพบว่าโพลิเมอร์ที่จับกับโลหะที่แสดงคุณ สมบัติเหมือนเอนไซม์นี้จะนำไปสู่การศึกษาปรับปรุงเพื่อประยุกต์ใช้ประโยชน์ต่อการรักษาในอนาคต สายเปปไทด์ที่มีคุณสมบัติจับกับโลหะได้ถูกนำมาประยุกต์ใช้ในการทำให้โปรตีนบริสุทธิ์ สายเปปไทด์นี้ถูกเชื่อมต่อเข้ากับ โปรตีนที่สนใจในระดับยีน จากพื้นฐานที่ว่า polyhistidine จับแน่นกับโลหะทรานสิชัน อาทิ Cu2+, Ni2+, Zn2+ á Co2+ ดังนั้นโปรตีนลูกผสมระหว่าง hexahistidine กับโปรตีนเรืองแสงฟลูออเรสเซนต์สีเขียว(green fluorescent protein) ซึ่งถูกสร้างมาจากวิธีทางพันธุวิศวกรรมนั้นสามารถทำให้บริสุทธิ์ได้โดยใช้ Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) ที่มี Zn2+ เป็นโลหะตัวกลาง โดยโลหะนี้ถูกเลือกเป็นตัวจับกับโปรตีนลูกผสมเนื่องมาจาก สามารถใช้เป็นตัวยืนยันคุณสมบัติการจับจำเพาะกับโลหะที่เกิดจากสายเปปไทด์มิใช่เกิดจากส่วนอื่นๆในโครงสร้างโปรตีน จากผล การทดลองพบว่าระดับของความบริสุทธิ์ของโปรตีนลูกผสมเมื่อพิจารณาจากสัดส่วนความบริสุทธิ์ในแต่ละขั้นตอนนั้นยังให้ค่าที่ไม่ สูงนักแต่อย่างไรก็ตามความบริสุทธิ์ที่ได้นั้นเพียงพอต่อการนำไปใช้งานและยังสามารถทำให้บริสุทธิ์ได้ในขั้นตอนเดียว นอกจากนั้น โปรตีนลูกผสมดังกล่าวยังถูกออกแบบให้มีตำแหน่งตัดจำเพาะด้วยเอนไซม์เอนเทอโรไคเนสเพื่อตัดสาย hexahistidine ทิ้งภาย หลังขั้นตอนการทำให้โปรตีนบริสุทธิ์ ในกรณีที่สายเปปไปด์อาจมีผลรบกวนคุณสมบัติและการทำงานของโปรตีนนั้น แต่จากผลการ ทดลองพบว่า สายเปปไทด์ที่มีคุณสมบัติจับกับโลหะและตำแหน่งตัดจำเพาะนั้นไม่มีผลรบกวนต่อคุณสมบัติการเรืองแสงของ โปรตีนและคุณสมบัติการจับจำเพาะกับเอนไซม์โปรตีเอส ซึ่งจากผลการทดลองเหล่านี้แสดงให้เห็นว่า สายเปปไทด์ที่มีคุณสมบัติจับ กับโลหะมีศักยภาพในการทำให้โปรตีนบริสุทธิ์ด้วยวิธีการที่ง่ายในขั้นตอนเดียว นอกจากนั้นโปรตีนเรืองแสงลูกผสมที่ถูกสร้างขึ้น นั้นยังสามารถนำไปประยุกต์ใช้เป็นเครื่องมือในการตรวจติดตามที่มีประสิทธิภาพในอนาคต

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Chartchalerm Isarankura Na Ayudhya

Role: Thesis Advisors

Created: 2003

Modified: 2553-03-31

Issued: 2010-03-30

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740435939

CallNumber: TH T375m 2003

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Medical Technology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4338107.pdf	5.5 MB	26	2018-07-25 22:51:16

ใช้เวลา

-0.748756 วินาที