Functional analysis of a Penicillium Marneffei gene involved in the fungal development

การศึกษาบทบาทของยีนต่อการเจริญของเชื้อราเพ็นนิซิเลี่ยมมาร์เนฟฟิไอ

Name: Supinya Pongsunk

LCSH: Dimorphism (Plants)

LCSH: Penicillium

Abstract: Since the explosive epidemic of AIDS, there ha s been a rapid rise in the number of case reports of penicilliosis marneffei, a disease caused by a dimorphic fungus Penicillium marneffei. Several studies have shown that yeast-hyphal transitions are involved in pathogenesis of dimorphic pathogenic fungi. Therefore, it is of interest to investigate genes involved in the control of dimorphism. Morphologically, P. marneffei yeast cells produced in vitro do not resemble yeast cells found in clinical specimens. In this study, it was found that 1% peptone is an essential supplement and is responsible for transition induction into yeasts. At 37°C, the inoculated conidia seemed to converted directly to yeast cells, the cycle that differed from those previous ly described for in vitro transition. Thus, this specific culture condition would be advantageous to obtain pure P. marneffei yeasts for future research on their respective roles such as virulence, invasiveness, and pathogenesis. Although several control mechanisms of fungal cell differentiation and development have been reported, little is known about transcriptional control of P. marneffei. As regulation at transcription level has been shown to be important in developmental responses of P. marneffei and TATA-binding protein (TBP) is a key general transcription initiation factor in eukaryotes, P. marneffei tbpA gene was isolated from P. marneffei strain RT-72. The deduced amino acids sequence of the tbpA cDNA sequence was predicted to encode a 255-amino acid polypeptide with a conserved C-terminal domain in comparison to TBP of other known fungi. Subsequently, a TBP overexpressing strain was generated by placing tbpA under the control of the xylP promoter of pXylNom (xylPp::tbpA). The construct was introduced into P. marneffei wild-type strain SPM4. This TBP overexpressing strain was then used to produce a P. marneffei tbpA-deleted strain via homologous recombination. The tbpA-deleted strain did not grow at 25°C but displayed a reduced growth rate at 37°C. The results suggested that TBP is necessary and essential for P. marneffei cell survival at 25°C and plays a less significant role on the control of fungal growth at 37°C. Inducible expression of ectopic copies of xylPp::tbpA by addition of 0.1% xylose could complement the growth defect of the tbpA-deleted strain at 25°C. However, significantly lower conidia l production was observed in the deletion strain as compare to the wild-type reflecting that the ectopic TBP could not complement the defect in conidia l formation. Taken together, the results suggest that P. marneffei TBP is involved in the formation of conidia despite its role in transcription initiation. Interestingly, phenotypic examination of growth of the tbpA overexpressing strains revealed that high TBP expression inhibits the fungal growth at conidial germination.

Abstract: การแพร่ระบาดของโรคเอดส์ทำให้มีรายงานของผู้ป่วยโรคเพนนิซิลิโอซิส มาร์เนฟฟิไอเพิ่มมากขึ้น โรคนี้มีสาเหตุมาจากการติดเชื้อราสองรูป Penicilliosis marneffei การศึกษาพบว่าการเปลี่ยนแปลงรูปร่างจากราสายเป็นยีสต์ของเชื้อราสองรูปนี้มีส่วนเกี่ยวข้องกับพยาธิสภาพของโรค รูปยีสต์ของเชื้อ P. marneffei ที่พบจากการเพาะเชื้อในหลอดทดลองที่อุณหภูมิ 37°C แตกต่างจากรูปยีสต์ที่พบในสิ่งส่งตรวจทางคลินิก ซึ่งในการทดลองครั้งนี้พบว่า peptone ที่ความเข้มข้น 1% เป็นอาหารเสริมที่มีส่วนสำคัญสำหรับการเปลี่ยนแปลงไปเป็นรูปยีสต์ และจากผลการทดลองนี้แสดงให้เห็นเป็นครั้งแรกว่า conidium สามารถเปลี่ยนแปลงไปเป็นรูปยีสต์ได้โดยตรงโดยไม่ผ่านกระบวนการ arthroconidiation ซึ่งแตกต่างจากการเปลี่ยนแปลงรูปร่างไปรูปยีสต์จากการทดลองคั้งก่อนๆในหลอดทดลอง ความสามารถในการเลี้ยงเชื้อ P. marneffei ให้เกิดรูปยีสต์ได้นี้จะเป็นประโยชน์ในการศึกษาบทบาทของเชื้อต่อความรุนแรง ความสามารถในการก่อโรค และพยาธิสภาพของโรค การพัฒนารูปร่างของเชื้อรานั้นมีกลไกมากมายที่ควบคุมการเปลี่ยนแปลงดังกล่าว แต่ความรู้ในส่วนที่เกี่ยวกับ transcriptional control ของเชื้อ P. marneffei มีเพียงเล็กน้อยเท่านั้น การควบคุมในระดับ transcription น่าจะเป็นส่วนสำคัญต่อการพัฒนาของเชื้อ P. marneffei เนื่องจาก TATA-binding protein (TBP) เป็น general transcription factor ที่เกี่ยวข้องในการทำให้เกิด transcription ใน eukaryotes การศึกษาครั้งนี้ได้ทำการแยกเป็น tbpA จากโครโมโซมของเชื้อ P. marneffei สายพันธุ์ RT-72 พบว่าลำดับนิวคลีโอไทด์ของ tbpA cDNA เมื่อแปลงเป็นโปรตีนจะมีกรดอะมิโนจำนวน 255 ตัว ส่วนปลายด้าน C-terminal ของ TBP เป็นส่วนที่มีความอนุรักษ์อย่างสูง TBP overexpressing strain ถูกสร้างขึ้น โดยการสร้าง recombinant DNA ของยีน tbpA โดยให้อยู่ภายใต้การควบคุมของ xylP โปรโมเตอร์ โครงสร้าง xylP::tbpA จะแทรกตัวเข้าไปอยู่ในโครโมโซมของ P. marneffei wild-type strain SMP4 แบบ random จากนั้น TBP overexpressing strain จึงถูกนำมาใช้ในการสร้าง P. marneffei tbpA-deleted strain โดยอาศัยกลไก homologous recombination พบว่า tbpA-deleted strain นี้จะไม่สามารถเจริญเติบโตได้ที่อุณหภูมิ 25˚C แต่ไม่มีผลกระทบต่อการเติบโตที่อุณหภูมิ 37˚C การเติม 0.1% xylose ในอาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อกระตุ้นการแสดงออกของ ectopic copies ของ xylPp::tbpA สามารถเสริมการเติบโตของ tbpA-deleted strain ได้ที่อุณหภูมิ 25˚C แต่อย่างไรก็ตามพบว่า ectopic TBP ไม่สามารถทดแทนความผิดปกติของการสร้าง conidia ซึ่งเห็นได้จากจำนวน conidia ที่ถูกสร้างขึ้นจาก tbpA-deleted strain ที่เลี้ยงในอาหารที่มี 0.1% xylose นั้นมีจำนวนน้อยมากเมื่อเทียบกับ wild-type ผลดังกล่าวแสดงให้เห็นว่า TBP ของ P. marneffei มีส่วนเกี่ยวข้องในการสร้าง conidia นอกเหนือจากหน้าที่ใน transcription initiation และการสร้าง TBP ในปริมาณสูงนั้นยับยั้งการเจริญเติบโตในขั้นตอน conidial germination

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Sansanee Chaiyaroj

Role: Thesis Advisors

Created: 2004

Modified: 2553-03-30

Issued: 2010-03-05

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740444148

CallNumber: TH S959fu 2004

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Microbiology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4136982.pdf	4.64 MB	25	2018-05-16 12:05:44

ใช้เวลา

0.293314 วินาที