Development of new L-glutamate assays based on L-glutamate dehydrogenase-D-phenylglycine aminotransferase cycling reactions

การพัฒนาวิธีการตรวจวัด แอล-กลูตาเมตแบบใหม่โดยใช้หลักการปฏิกิริยาหมุนเวียนของเอนไซม์ ดี-ฟินิลกลัยซีน อะมิโนทรานสเฟอเรสและแอล-กลูตาเมต ดีไฮโดรจีเนส

Name: Wanida Khampha

LCSH: Aminotransferases

LCSH: Flow injection analysis

Abstract: Three assay formats e.g. batch, flow injection analysis (FIA), and microfluidic method, for L-glutamate assay have been developed. The methods are based on substrate recycling using L-glutamate dehydrogenase (GlDH) and D-phenylglycine aminotransferase (D-PhgAT). GlDH converts L-glutamate to 2-oxoglutarate with concomitant reduction of NAD+ to NADH. The 2-oxoglutarate is recycled to Lglutamate in a reaction catalyzed by D-PhgAT using D-4-hydroxyphenylglycine as an amino donor, which is converted to 4-hydroxybenzoylformate. Both NADH and 4- hydroxybenzoylformate strongly absorb UV light at 340 nm, thus offer high sensitivity to the batch method with the limit of detection (LOD) of 0.14 μM Lglutamate. The calibration curve for L-glutamate was linear from 0.2-20 μM. By using the FIA method, the enzymes were co-immobilized on controlled-pore glass. The high sensitivity was similarly obtained when using either fluorescent- or UV- FIA methods, with the LOD of 0.4 or 0.7 μM, respectively, and an assay range of 2.5-20 μM. The results from both the batch and the FIA methods were well correlated with a commercial method (r2 = 0.998). The FIA method had good long-term stability (70 days) and reproducibility (within-day and between-day RSDs were 4.3–7.3% and 8.9%, respectively). In the microfluidic based system, the enzymes were immobilized on (i) the surface of silicon microchips (42 porous flow channels, 10 mm length, 235 μm depth, 25 μm width), and (ii) polystyrene beads (particle size 20 μm). For the microchip-based system (i), L-glutamate was detected within a range of 3.13-50 μM, however, immobilized enzymes displayed a dramatic decrease in activity with time. The bead-based system (ii) was developed for used with both the FIA and the sequential injection analysis (SIA) modes, where good reproducibility for L-glutamate calibrations was obtained (RSDs of 3.27 and 6.57%, respectively). In the case of SIA the beads were introduced and removed from the microchip automatically, which is suitable for routine analyses. The immobilized beads could be stored for at least 15 days with 72% of the activity remained. All developed methods demonstrated high selectivity, where L-glutamate recovery was between 91-108%, in the presence of various D or L-amino acids tested

Abstract: วิธีการตรวจวัดปริมาณกลูตาเมต 3 รูปแบบ ได้แก่ ระบบ batch, ระบบ Flow Injection Analysis (FIA), และ ระบบ microfluidic ได้ถูกพัฒนาขึ้น โดยใช้หลักการการหมุนเวียนของสับสเตรท และเอนไซม์กลูตาเมต ดี ไฮโดรจีเนส (GlDH) ร่วมกับ ดี-ฟินิลกลัยซีน อะมิโนทรานสเฟอเรส (D-PhgAT) เอนไซม์ GlDH เปลี่ยน กลูตาเมต เป็นคีโตกลูทาเรต พร้อมกับการเพิ่มไฮโดรเจนแก่สาร NAD+ และทำให้เกิดสาร NADH ขึ้นในปฏิกิริยา สารคี- โตกลูทาเรต ถูกเปลี่ยนกลับเป็นกลูตาเมต ด้วยปฏิกิริยาของเอนไซม์ D-PhgAT โดยใช้ D-4-hydroxyphenylglycine เป็นตัวให้หมู่อะมิโน และทำให้เกิด 4-hydroxybenzoylformate ขึ้น สารผลิตภัณฑ์ทั้งสองตัวที่เกิดขึ้นสามารถ ดูดกลืนแสงได้ดีที่ความยาวคลื่น 340 nm ทำให้วิธี batch มีความไวสูง โดยมี limit of detection (LOD) สำหรับ กลูตาเมตเป็น 0.14 μM และมี linear range 0.2-20 μM ด้วยวิธี FIA เอนไซม์ทั้งสองถูกตรึงบน CPG ทั้งวิธี ตรวจวัดด้วยฟลูออเรสเซนท์ หรือ ยูวี มีความไวที่ดีใกล้เคียงกัน มี LOD เป็น 0.4 และ 0.7 μM ตามลำดับ และ มี assay range 2.5-20 μM เมื่อใช้วิธี batch และ FIA มาตรวจวัดปริมาณกลูตาเมตในตัวอย่างอาหารจริง ให้ผลการ วิเคราะห์ที่สัมพันธ์ที่ดีกับวิธีที่เป็นชุดตรวจสอบสำเร็จรูป (r2 = 0.998) เอนไซม์คอลัมน์ใน FIA มีความคงตัวอย่าง น้อย 70 วัน และมีค่า reproducibility ที่ดี เมื่อทำการวิเคราะห์ภายใน และระหว่างวัน (RSDs เป็น 4.3–7.3% และ 8.9% ตามลำดับ) วิธีการตรวจวัดที่ใช้ หลักการ microfluidic ให้เอนไซม์ถูกตรึงบน (1) ผิวหน้าของ silicon microchip ที่มี 42 ช่องการไหล และมีรูพรุน ยาว 10 mm ลึก 235 μm กว้าง 25 μm หรือ (2) ตรึงบน polystyrene beads (ขนาด 20 μm) จากวิธีการตรึงแบบแรกสามารถนำมาใช้ตรวจวัดกลูตาเมตได้ในช่วง 3.13-50 μM แต่พบว่า มีความคงตัวของเอนไซม์ต่ำมาก ดังนั้นจึงได้ใช้ระบบการตรึงเอนไซม์บน beads ขนาดเล็ก และได้พัฒนาวิธีการ ตรวจวัดในระบบ FIA และ SIAโดยมีค่า reproducibility ที่ดี เมื่อทำการสร้างกราฟมาตรฐานพบว่ามีค่า RSDs เป็น 3.27 และ 6.57% ตามลำดับ ด้วยระบบ SIA เอนไซม์ที่ถูกตรึงบน beads สามารถถูกนำเข้าและออกจาก microchip โดยอัตโนมัติ ซึ่งเหมาะสมกับการใช้งานประจำวัน beads ที่มีเอนไซม์ตรึงแล้วสามารถเก็บไว้ได้อย่างน้อย 15 วัน โดยสัญญาณการตรวจวัดเหลือ 72% วิธีการตรวจวัดกลูตาเมตทั้งสามวิธีที่นำเสนอ มีความจำเพาะสูงต่อแอล-กลูตา เมต โดยมีค่า recovery ระหว่าง 91-108% เมื่อทำการทดสอบร่วมกับกรดอะมิโน ชนิด ดี และ แอล ชนิดอื่น ๆ

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Vithaya Meevootisom

Role: Thesis Advisors

Created: 2004

Modified: 2553-03-20

Issued: 2010-02-24

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740454356

CallNumber: TH W247dn 2004

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Microbiology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4336005.pdf	2.21 MB	52	2020-04-24 11:14:46

ใช้เวลา

0.274821 วินาที