Genetic engineering of d-phenylglycine aminotransferase to facilitate immobilization and maximize catalytic performance

การดัดแปลงโครงสร้างโมเลกุลของเอนไซม์ดี-ฟินิลกลัยซีน อะมิโนทรานสเฟอเรสโดยใช้เทคนิคพันธุวิศวกรรมเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพในการตรึงและสมรรถนะในการเร่งปฏิกิริยา

Name: Theerasak Rojanarata

LCSH: Aminotransferases

LCSH: Controlled release technology

LCSH: Enzymes

LCSH: Genetic engineering

Abstract: D-Phenylglycine aminotransferase expressed by Escherichia coli that contains the cloned gene from Pseudomonas stutzeri ST-201 catalyzes the stereo-inverting transamination of L-glutamate and benzoylformate to yield D-phenylglycine and α-ketoglutarate. In this thesis, the enzyme was immobilized and applied for the synthesis of enantiomerically pure D-phenylglycine in a single step without the use of any amino acid racemases. Since the enzyme showed decreased activity with random immobilization, it was genetically engineered to replace serine 453 at the carboxy terminus with cysteine. In comparison with the wild type, the modified enzyme showed comparable catalytic activity and kinetic properties, but could be immobilized onto Thiopropyl Sepharose 6B via disulfide bond formation at a faster rate and a higher yield. Furthermore, the immobilized modified enzyme had a higher specific activity than the immobilized wild type enzyme. The optimal operating condition for D-phenylglycine synthesis using the immobilized modified enzyme was 37°C and pH 7.5 in PIPES buffer. Nevertheless, the reaction was characterized by an unfavorable equilibrium constant and with substrate inhibition by benzoylformate. To overcome these constraints, a high concentration of Lglutamate was used to drive the reaction against the unfavorable equilibrium. Also, a controlled-release system via the use of Amberlite IRA-400-adsorbed benzoylformate was employed to slowly release benzoylformate during the course of the reaction to minimize its inhibition effect. Fortunately, the resin did adsorb α-ketoglutarate resulting in the simultaneous removal of this by-product, and thus, driving the reaction forward. Furthermore, with this system, a high concentration of D-phenylglycine product could now potentially be synthesized with no or minimal product inhibition from D-phenylglycine because when the concentration was higher than its saturation level of 35 mM, the product would precipitate out of solution. The low solubility of D-phenylglycine offered advantages in shifting the reaction equilibrium as well as facilitating the recovery of the pure product. From a 1 ml reaction, which was composed of 1 M L-glutamate and 0.1 M benzoylformate adsorbed on the resin, an improvement in productivity was achieved to yield a final D-phenylglycine concentration of 0.068 M (10.25 mg/ml).

Abstract: เอนไซม์ดี-ฟินิลกลัยซีน อะมิโนทรานสเฟอเรสซึ่งสร้างโดย Escherichia coli จากการโคลนยีนที่ได้จาก Pseudomonas stutzeri ST-201 สามารถเร่งปฏิกิริยาทรานสอะมิเนชั่นแบบ stereo-inverting ระหว่างแอล-กลูตาเมต และเบนโซอิลฟอร์เมตได้เป็นดี-ฟินิลกลัยซีนและแอลฟา-คีโตกลูตาเรต วิทยานิพนธ์นี้เป็นการตรึงเอนไซม์ชนิดนี้ เพื่อนำไปใช้ในการสังเคราะห์ enantiomerically pure D-phenylglycine ในขั้นตอนเดียวและไม่ใช้เอนไซม์อะมิโน แอซิด-ราซีเมสใด เนื่องจากเอนไซม์ดี-ฟินิลกลัยซีน อะมิโนทรานสเฟอเรสมีแอคทิวิตีลดลงเมื่อถูกตรึงไว้บน เมทริกซ์แบบสุ่ม จึงได้ทำการดัดแปลงโครงสร้างโมเลกุลด้วยเทคนิคพันธุวิศวกรรมโดยการแทนที่เซอรีนที่ ตำแหน่ง 453 ณ ปลายสุดของด้านคาร์บอกซีด้วยซิสเตอีน เมื่อศึกษาเปรียบเทียบพบว่าเอนไซม์ที่ถูกดัดแปลงนี้มี ความสามารถในการเร่งปฏิกิริยาและคุณสมบัติทางจลนศาสตร์ไม่แตกต่างจากเอนไซม์ดั้งเดิม แต่สามารถถูกตรึง บน Thiopropyl Sepharose 6B โดยการเกิดพันธะไดซัลไฟด์ด้วยอัตราที่เร็วกว่าและในปริมาณที่มากกว่า นอกจากนี้ เอนไซม์ตรึงรูปของเอนไซม์ที่ถูกดัดแปลงยังมีแอคทิวิทีจำเพาะสูงกว่าเอนไซม์ตรึงรูปของเอนไซม์ดั้งเดิม เมื่อนำเอนไซม์ดัดแปลงที่ถูกตรึงไปใช้ในการสังเคราะห์ดี-ฟินิลกลัยซีน พบว่าสภาวะที่เหมาะสมที่สุดคือ ณ อุณหภูมิ 37oC pH 7.5 ในบัฟเฟอร์ PIPES อย่างไรก็ตาม ปฏิกิริยาการสังเคราะห์ดี-ฟินิลกลัยซีนมีค่าคงที่ สมดุลต่ำ และการทำงานของเอนไซม์ยังถูกยับยั้งเมื่อใช้สารตั้งต้นเบนโซอิลฟอร์เมต ณ ความเข้มข้นสูง ดังนั้น เพื่อแก้ปัญหาดังกล่าว ปฏิกิริยาจึงถูกผลักดันโดยการใช้สารตั้งต้นแอล-กลูตาเมตที่มีความเข้มข้นสูง ร่วมกับการใช้ เบนโซอิลฟอร์เมตในรูปที่ถูกจับไว้กับเรซิน Amberlite IRA-400 สำหรับปลดปล่อยสารตั้งต้นชนิดนี้ออกมาใน ความเข้มข้นต่ำอย่างช้าเพื่อลดปัญหาการถูกยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ นอกจากนี้ เรซินชนิดนี้ยังสามารถจับกับ แอลฟา-คีโตกลูตาเรตที่เกิดขึ้นในปฏิกิริยา เป็นการกำจัดผลิตภัณฑ์ที่ไม่ต้องการนี้ออกจากปฏิกิริยาได้ในเวลา เดียวกันและช่วยผลักดันให้ปฏิกิริยาดำเนินต่อไปในทิศทางที่ต้องการ ด้วยวิธีการดังกล่าว ทำให้สังเคราะห์ ผลิตภัณฑ์ดี-ฟินิลกลัยซีนได้ในปริมาณที่สูงเกินความสามารถในการละลาย (35 มิลลิโมลาร์) จนทำให้ ดี-ฟินิลกลัยซีน ตกผลึกออกมาในที่สุด ส่งผลดีต่อการผลักสมดุลของปฏิกิริยา รวมทั้งทำให้ได้ผลิตภัณฑ์ที่มีความ บริสุทธิ์สูงและสะดวกต่อการเก็บ จากปฏิกิริยาการสังเคราะห์ปริมาตร 1 มิลลิลิตรที่มีแอล-กลูตาเมต 1 โมลาร์ และเบนโซอิลฟอร์เมต 0.1 โมลาร์ซึ่งถูกจับไว้กับเรซินเป็นสารตั้งต้นสามารถสังเคราะห์ดี-ฟินิลกลัยซีนได้สูงใน ระดับ 0.068 โมลาร์ (10.25 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร)

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Vithaya Meevootisom

Role: Thesis Advisors

Created: 2004

Modified: 2553-03-29

Issued: 2010-02-17

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740452248

CallNumber: TH T375g 2004

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Microbiology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4236992.pdf	1.26 MB	10	2018-05-29 03:10:21

ใช้เวลา

-0.763337 วินาที