Detection and differentiation of vibrio cholerae O1, O139 and non-O1 isolates in seafood samples by touch down multiplex polymerase chain reaction

การตรวจและจำแนกเชื้อ vibrio cholerae O1, O139 และ non-O1 ในตัวอย่างอาหารทะเลโดยวิธี touch down multiplex polymerase chain reaction

Name: Junya Sanurjai

MeSH: Polymerase Chain Reaction

MeSH: Seafood

MeSH: Vibrio cholerae

Abstract: The advent of genetics-based identification methods for pathogenic Vibrio cholerae O1 and O139 has great advantages in speed and specificity. The objectives of this study were to detect the degree of contamination in 330 seafood samples, using standard culture method, to detect the presence of V. cholerae O1, O139 and non-O1 as well as differentiating between the V. cholerae isolates in seafood samples by the previously designed touch down multiplex polymerase chain reaction (TM-PCR) method. All seafood samples collected from the small preprocessing stations and local markets in Samutsakorn Province and Bangkok, from October 2002 to March 2004. The detection limits of V. cholerae O1, O139 and non-O1 in artificially seeded seafood homogenates were 7.3×106 Colony Forming Units (CFU)/g (7.3×103 CFU per reaction), 1.8×106 CFU/g (1.8×103 CFU per reaction) and 6.6×106 CFU/g (6.6×103 CFU per reaction), respectively. Of the 330 seafood samples detected for contamination of V. cholerae O1, O139 and non-O1 by standard culture method, 54.8% (181/330) were positive for V. cholerae both O1 and/or non-O1. Among these positive samples, 5.8% (19/330) were positive for V. cholerae O1 and 53.6% (177/330) were positive for V. cholerae non-O1. V. cholerae O139 was not detected in all samples by either method. The detection rate of V. cholerae in enrichment cultures (173/330, 52.4%) was significantly higher than that in direct cultures (58/330, 17.6%) (p<0.05). No amplicons of V. cholerae (O1, O139 and non-O1) were directly detected in 330 homogenized seafood enriched cultures stored at -20°C for more than 6 months by TM-PCR. However, 3 out of 7 freshly prepared enrichment positive cultures were positive for V. cholerae non-O1 (588 bp). In addition, all 326 V. cholerae non-O1 and 22 V. cholerae O1 isolates obtained by conventional culture method produced the same results when tested by TM-PCR. For the assessment of microbiological quality of seafood samples according to Food and Environmental Hygiene criteria, it was found that 54.8% (181/330) of the seafood samples were contaminated for V. cholerae O1 and/or non-O1 at the unacceptable level. The results of this study suggest that TM-PCR method might be able to detect and differentiate V. cholerae O1, O139 and non-O1 in enriched culture samples after overnight incubation. However, it was found that TM-PCR was not functional with enriched culture samples that were frozen and stored. Moreover, the study concludes that TM-PCR method is capable of differentiating V. cholerae isolates in seafood.

Abstract: การพัฒนาวิธีการตรวจวิเคราะห์ทางพันธุกรรมสำหรับการจำแนกเชื้อ Vibrio cholerae O1 และ O139 สาย พันธุ์ก่อโรคนั้นมีประโยชน์อย่างมากในด้านความรวดเร็วและความจำเพาะ ในการศึกษาครั้งนี้ได้ใช้วิธีการเพาะเลี้ยงเชื้อซึ่ง เป็นวิธีมาตรฐานทางจุลชีววิทยาตรวจเชื้อ V. cholerae O1, O139 และ non-O1 ที่ปนเปื้อนในตัวอย่างอาหารทะเล และ ได้นำวิธีการเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรมด้วยปฏิกิริยาลูกโซ่แบบ touch down multiplex polymerase chain reaction (TM-PCR) ที่พัฒนาแล้วมาใช้ เพื่อการตรวจและจำแนกเชื้อ V. cholerae O1, O139 และ non-O1 ในตัวอย่างอาหาร ทะเลจำนวน 330 ตัวอย่าง ที่เก็บจากสถานแปรรูปเบื้องต้นและตลาดในจังหวัดสมุทรสาครและกรุงเทพมหานคร ระหว่าง เดือนตุลาคม 2002 ถึง เดือนมีนาคม 2004 การศึกษาครั้งนี้ได้เติมเชื้อ V. cholerae ทั้ง 3 ชนิดลงในตัวอย่างอาหารทะเลที่ไม่มีการปนเปื้อนเชื้อ V. cholerae เพื่อใช้ทดสอบความไวในการตรวจหาดีเอ็นเอของเชื้อ V. cholerae ด้วยวิธี TM-PCR พบว่าวิธี TM-PCR สามารถตรวจพบเชื้อ V. cholerae O1 น้อยที่สุดประมาณ 7.3×106 Colony Formiming Units (CFU)/g (7.3×103 CFU ต่อปฏิกิริยา PCR) เชื้อ V. cholerae O139 ประมาณ 1.8×106 CFU/g (1.8×103 CFU ต่อปฏิกิริยา PCR) และเชื้อ V. cholerae non-O1 น้อยที่สุดประมาณ 6.6×106 CFU/g (6.6×103 CFU ต่อปฏิกิริยา PCR) สำหรับผลการเพาะเชื้อจากตัวอย่างอาหารทะเลจำนวน 330 ตัวอย่างพบว่า มีการปนเปื้อน V. cholerae O1 และหรือ non-O1 ร้อยละ 54.8 (181/330) พบการปนเปื้อนเชื้อ V. cholerae O1 ร้อยละ 5.8 (19/330) และเชื้อ V. cholerae non-O1 ร้อยละ 53.6 (177/330) แต่ไม่พบการปนเปื้อนของ V. cholerae O139 จากการตรวจทั้งสองวิธี จากการเพาะ เชื้อจากตัวอย่างอาหารทะเลในอาหารเสริมตรวจพบ V. cholerae ร้อยละ 52.4 (173/330) ซึ่งสูงกว่าจากวิธีการเพาะเชื้อ จากอาหารทะเลโดยตรง (17.6%; 58/330) อย่างมีนัยสำคัญ (p<0.05) วิธี TM-PCR ตรวจไม่พบแถบดีเอ็นเอของเชื้อ V. cholerae ทั้ง O1, O139 และ non-O1 จากตัวอย่างอาหารทะเลในอาหารเสริมจำนวน 330 ตัวอย่างที่เก็บที่อุณหภูมิ -20°C มากกว่า 6 เดือน อย่างไรก็ตามเมื่อสกัดดีเอ็นเอทันทีหลังจากเพาะเชื้อจากตัวอย่างอาหารทะเลในอาหารเสริม พบว่า วิธี TM-PCR ตรวจพบแถบดีเอ็นเอ ของ V. cholerae non-O1 จำนวน 3 ตัวอย่าง ใน 7 ตัวอย่างที่ผลการเพาะเชื้อ V. cholerae non-O1 เป็นบวกเช่นกัน นอกจากนี้ V. cholerae non-O1 จำนวน 326 ไอโซเลท และ O1 จำนวน 22 ไอโซเลท ที่แยกได้จากวิธีการเพาะเชื้อ สามารถจำแนกได้เป็นซีโรกรุ๊ป non-O1 และ O1 ได้ตรงกันทุกสายพันธุ์ โดยวิธี TM-PCR จากการประเมินคุณภาพอาหารตามเกณฑ์ของ Food and Environmental Hygiene พบตัวอย่างอาหารทะเล ปนเปื้อน V. cholerae O1 และหรือ non-O1 ร้อยละ 54.8 (181/330) ในระดับที่ไม่ผ่านเกณฑ์ความปลอดภัยของ อาหารทะเล ผลการศึกษาครั้งนี้แสดงให้เห็นว่า วิธี TM-PCR อาจเป็นวิธีที่สามารถตรวจและจำแนก V. cholerae O1, O139 และ non-O1 ในตัวอย่างอาหารทะเลในอาหารเสริมหลังจากบ่มค้างคืน แต่พบว่าไม่สามารถตรวจในตัวอย่าง อาหารทะเลในอาหารเสริมที่ผ่านการเก็บแช่แข็งไว้ ยิ่งไปกว่านั้นการศึกษานี้สรุปได้ว่าวิธี TM-PCR สามารถตรวจ วิเคราะห์ยืนยันเชื้อ V. cholerae ที่แยกได้จากอาหารทะเล

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Orasa Suthienkul

Role: Thesis Advisors

Created: 2004

Modified: 2553-05-11

Issued: 2010-02-15

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740450342

CallNumber: TH J95d 2004

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Infectious Diseases and Epidemiology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4436074.pdf	4.08 MB	49	2024-08-20 15:20:12

ใช้เวลา

-0.709462 วินาที