Functional characterisation of Asn-166 and Tyr-170 in the alpha4-alpha5 loop of the bacillus thuringiensis Cry4Ba toxin

การศึกษาหน้าที่ของกรดอะมิโน Asn-166 และ Tyr-170 ในส่วนเชื่อมต่อเกลียวอัลฟาที่ 4 และ 5 ของโปรตีน Cry4Ba จากแบคทีเรีย bacillus thuringiensis

Name: Yodsoi Kanintronkul

LCSH: Aromaticity (Chemistry)

LCSH: Atomic force microscopy

LCSH: Bacillus thuringiensis

LCSH: Ion channels

LCSH: Perturbation (Mathematics)

LCSH: Polarity

Abstract: Bacillus thuringiensis Cry δ-endotoxins have been shown to kill susceptible insect larvae by forming a lytic pore in the membrane of target midgut epithelial cells. Previously, polarity of Asn-166 and aromaticity of Tyr-170 located within the α4-α5 loop of Cry4Ba were shown to play a crucial role in toxicity against Aedes aegypti larvae. In this study, a possible role in toxicity mechanism of Asn-166 and Tyr-170 was further investigated. The results showed that channel conductances on planar lipid bilayers and membrane perturbing activity on calcein entrapped liposomes of larvicidal inactive N166A, N166Y and N166I mutants were much lower than that of the wild type. However, the bio-inactive Y170D mutant exhibited conductance values comparable to the wild type but showed a decrease in perturbing activity. Molecular dynamics simulations of hexameric α4-α5 pore models revealed a decrease in the extent of hydrogen-bonding at position 166 with water molecules when Asn-166 was substituted with Ile. The 65-kDa wild-type toxin was found to be cytotoxic to A. albopictus C6/36 cells with an LC50 of 14 μg/ml, but no cytolytic activity was observed for the larvicidal inactive Y170D mutant. Atomic force microscopic analysis revealed that the interaction strength of the inactive Y170D mutant toxin-receptor complex on C6/36 cell surface was characterised by a force of 42.4 ± 12.3 pN, which was similar to that of the wildtype toxin (43.3 ± 8.9 pN). These results suggested that a crucial role for Asn-166 in Cry4Ba larvicidal activity is conceivably involved in ion conduction, while Tyr-170 is likely to be involved in stabilisation of toxin-induced pore rather than in ion conduction and receptor recognition.

Abstract: แบบจำลองกลไกการออกฤทธิ์ของโปรตีนสารพิษจาก Bacillus thuringiensis นั้นเกี่ยวข้องกับ การเกิดรูรั่วบนผนังหุ้มเซลล์บุกระเพาะแมลงตัวอ่อน งานวิจัยก่อนหน้านี้พบว่าความมีขั้วของกรดอะมิโน Asparagine ที่ตำแหน่ง 166 และ โครงสร้างแบบ aromatic ของกรดอะมิโน Tyrosine ที่ตำแหน่ง 170 ในส่วนเชื่อมต่อเกลียวอัลฟาที่ 4 และ 5 นั้น มีความสำคัญต่อฤทธิ์ฆ่าลูกน้ำยุงลาย (Aedes aegypti) ของ โปรตีน Cry4Ba ในงานวิจัยนี้ได้ศึกษาเพิ่มเติมพบว่าความสามารถในการนำไฟฟ้าผ่านผนังเยื่อหุ้มโดยการทำ ให้เกิดรูอิออน (ion channel) และความสามารถที่ทำให้เกิดการแตกของ liposome ของโปรตีนกลายพันธุ์ N166A, N166Y และ N166I ซึ่งสูญเสียความเป็นพิษต่อลูกน้ำยุงลายนั้น ลดลงจากค่าของโปรตีนต้นแบบ Cry4Ba อย่างไรก็ตามค่าการนำไฟฟ้าของโปรตีนกลายพันธุ์ Y170D ที่สูญเสียความเป็นพิษต่อลูกน้ำยุง ไม่ต่างจากโปรตีนต้นแบบ แต่ความสามารถที่ทำให้เกิดการแตกของliposome ลดลง นอกจากนี้เมื่อศึกษา จำนวนพันธะไฮโดรเจนระหว่างโปรตีนกับน้ำ โดยอาศัยแบบจำลองรูรั่วที่เกิดจากชิ้น อัลฟา 4 และ อัลฟา 5 พบว่า จำนวนพันธะไฮโดรเจนที่ตำแหน่ง N166I สูญเสียความสามารถในการฆ่าลูกน้ำยุงนั้นลดลงสอดคล้อง กับค่าการนำไฟฟ้าและเมื่อศึกษาความสามารถในการฆ่าเซลล์ยุงลาย (A. albopictus C6/36 cells) ของ โปรตีนต้นแบบ ให้ค่า LC50 ประมาณ 14 μg/ml ในขณะที่โปรตีน Y170D ที่สูญเสียความสามารถในการ ฆ่าลูกน้ำยุงลายนั้น ไม่แสดงความเป็นพิษต่อเซลล์ดังกล่าว จากการศึกษาปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนกับพื้นผิว ของเซลล์ลูกน้ำยุงลาย โดยใช้เทคนิค Atomic force microscopy พบว่า แรงระหว่าง โปรตีนต้นแบบ กับ พื้นผิวเซลล์ ได้ค่าใกล้เคียงกับของ Y170D คือค่าประมาณ 40 pN จากการศึกษาทั้งหมดสามารถเสนอแนะ ได้ว่าความมีขั้วของกรดอะมิโน Asn-166 นั้น น่าจะเกี่ยวข้องกับความสามารถในการไหลผ่านของอิออนบน ผนังเยื่อหุ้ม ส่วนโครงสร้าง aromatic ของ Tyr-170 นั้นน่าจะเกี่ยวข้องกับการรักษาเสถียรภาพของรูรั่ว มากกว่าการเหนี่ยวนำอิออนและการเกิดปฏิสัมพันธ์กับตัวรับบนพื้นผิวเซลล์

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Chanan Angsuthanasombat

Role: Thesis Advisors

Created: 2004

Modified: 2553-03-24

Issued: 2010-02-15

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740449441

CallNumber: TH Y54f 2004

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Molecular Genetics and Genetic Engineering

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4437588.pdf	7.21 MB	8	2018-05-29 03:01:48

ใช้เวลา

0.289273 วินาที