Investigation, cloning and expression of Alpha-MKN and Beta-MKN genes from Momordica Charantia L. locally cultivated in Thailand

การศึกษาการโคลนนิ่งและการแสดงออกของยีน Alpha-MKN และ Beta-MKN จากมะระขี้นกที่เพาะปลูกในประเทศไทย

Name: Chanikarn Boonchoy

MeSH: Escherichia coli

MeSH: Gene Expression

MeSH: Ribosomes

Abstract: Bitter melon or Mara Khee Nok (Momordica charantia L.), a common vegetable in Thailand, has been used as a traditional medicine. Ribosome inactivating proteins (RIPs), a group of proteins possessing some pharmacological activities e.g. anti-HIV and anti-cancer properties, are found abundantly in this plant. The therapeutic potential with cloning and expression of recombinant RIPs proteins could be investigated. Alpha-momorcharin and MAP30 that are classified as type I RIPs, were isolated from the seeds of M. charantia L. They possess similar structural and biological properties. Both proteins contain basic glycoprotein with pI>8 and molecular weight of approximately 29-30 kDa. In this study, alpha-momorcharin and MAP30 related gene were cloned and sequenced. The names of alpha-momorcharin and MAP30 related genes amplified from Mara Khee Nok were designated as alpha-MKN and beta-MKN, respectively. The DNA fragments containing alpha and beta-MKN genes were isolated and cloned into pGEM-T Easy vector. Nucleotide sequences of alpha-MKN and beta-MKN were matched to the sequence of alpha-momorcharin and MAP30 at 99.5% and 99% identities respectively. Amino acid sequences alignment of alpha-MKN with alpha-momorcharin showed the two mutated amino acid residues at position 53: F53Y and position 153: V153A. The beta- MKN gene was subcloned into two expression vectors, pET32b and pET28a. The pET32b vector was used to produce fusion beta-MKN protein which contained thioredoxin protein, His•Tag, and enterokinase cleavage site fused to the N-terminus of beta-MKN protein. The protein was called N-terminal fusion beta-MKN protein and the size was 49 kDa. The Nterminal fusion beta-MKN protein was detected and purified by affinity chromatography. The second vector, pET28a, was used to express beta-MKN protein, without fusion. Nterminal fusion beta-MKN protein was produced at a higher level than beta-MKN protein. The proteins, presumably similar to alpha-momorcharin and MAP30 from seeds of M. charantia L., were collected and separated by ion-exchange chromatography. The purified protein similar to alpha-momorcharin possessed anti-tumor activity against Human epidermoid carcinoma of cavity (KB) and Breast cancer cell line (BC) showing the IC50 at 1.56 and 1.03 μg/ml, respectively, whereas the protein similar to MAP30 was effective only to BC cell with IC50 at 4.56 μg/ml. Anti-HSV-1 activity was measured. The protein similar to alpha-momorcharin was effective against HSV-1 with IC50 at 0.7 μg/ml.

Abstract: มะระขี้นก (Momordica charantia L.) เป็นผักที่พบทั่วไป โดยจะนำ มาใช้เป็นยาพื้นบ้าน ในมะระขี้นก มีโปรตีนกลุ่มหนึ่งที่มีฤทธิ์ยับยั้งไรโบโซม หรือเรียกว่า RIPs (Ribosome inactivating proteins) ซึ่งเป็นโปรตีน ที่มีฤทธิ์ทางเภสัชวิทยา เช่นในการยับยั้งเชื้อเชื้อไวรัสที่ก่อโรคเอดส์ (anti-HIV) และมีคุณสมบัติเป็นสารต้าน มะเร็ง (anti-tumor) ดังนั้นจึงได้ทำ การศึกษาประสิทธิภาพของโปรตีนในทางยา โดยเทคนิคการโคลนนิ่ง และ การแสดงออกของยีนที่กำ หนดการสร้างโปรตีนเหล่านี้ alpha-momorcharin และ MAP30 จัดว่าอยู่ในกลุ่ม RIPs type I ซึ่งแยกได้จากเมล็ดของมะระ โปรตีนทั้งสองมีโครงสร้างและคุณสมบัติทางชีววิทยาที่คล้ายกันมาก คือ มีไกลโคโปรตีน มีค่า pI >8 และมี ขนาด 29-30 kDa ในการศึกษาครั้งนี้ได้นำ ยีนที่คล้ายกับ alpha-momorcharin และ MAP30 มาโคลน และศึกษา การเรียงลำ ดับเบส โดยเรียกชื่อยีนที่คล้ายกับ alpha-momorcharin และ MAP30 ว่า alpha-MKN และ beta- MKN ตามลำ ดับ ชิ้น DNA ที่มียีน alpha-MKNและ beta-MKN ได้ถูกแยกและโคลน ในเวกเตอร์ pGEM-T Easy การเรียงลำ ดับของเบส ทั้ง alpha-MKNและ beta-MKN มีความคล้ายกับalpha-momorcharin และ MAP30 ถึง 99.5% และ 99% ตามลำ ดับ เมื่อเปรียบเทียบการเรียงลำ ดับกรดอะมิโนระหว่าง alpha-MKN กับ alpha-momorcharin พบว่าที่ตำ แหน่ง 53 เปลี่ยนจาก Phe เป็น Tyr และที่ตำ เเหน่ง 153 เปลี่ยนจาก Val เป็น Ala โดยยีน beta-MKN ถูกสับโคลนและนำ สู่ expression vector 2 ชนิดได้แก่ pET32b และ pET28a โดย pET32b จะสร้าง beta-MKN รวมกับ thioredoxin, His•Tag และบริเวนที่ตัดด้วย enterokinase ที่ N-terminal และ เรียก โปรตีนว่า N-terminal fusion beta-MKN มีขนาด 49 kDa และทำ ให้บริสุทธิ์โดย Affinity chromatography ขณะ ที่ pET28a จะสร้างโปรตีน ชื่อ beta-MKN ที่ไม่มีส่วนเชื่อม โดยโปรตีน N-terminal fusion beta-MKNจะผลิต ได้ในระดับที่สูงกว่าโปรตีน beta-MKN โปรตีนที่คล้ายกับ alpha-momorcharin และ MAP30 จากเมล็ดมะระ แยกโดย ion-exchange chromatography โดยมีฤทธิ์ต้านเซลมะเร็ง Human epidermoid carcinoma of cavity (KB) and Breast cancer cell line (BC) ที่ IC50 1.56 และ 1.03 μg/ml ตามลำ ดับ ในโปรตีนที่คล้ายกับ alpha-momorcharin ขณะที่ โปรตีนที่คล้ายกับ MAP30 มีผล ต่อ BC ที่ IC50 4.56 μg/ml เท่านั้น ฤทธิ์ในการต่อต้าน HSV-1 ถูกนำ มาศึกษา และพบว่า โปรตีนที่คล้าย กับ alpha-momorcharin มีฤทธิ์ต้าน HSV-1 ที่ IC50 0.7 μg/ml

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Arome Pongpan

Role: Thesis Advisors

Created: 2004

Modified: 2553-04-26

Issued: 2010-02-05

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740444474

CallNumber: TH C456i 2004

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Biopharmaceutical Sciences

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4337554.pdf	5.44 MB	56	2022-12-06 18:18:06

ใช้เวลา

0.255469 วินาที