Multiplex RT-PCR for detection of influenza virus and amantadine susceptibility by hemagglutination inhibition assay

การตรวจหาไวรัสไข้หวัดใหญ่ด้วยวิธี multiplex RT-PCR และการทดสอบความไวต่อยา amantadine ด้วย hemagglutination inhibition assay

Name: Thipwipha Phonpakobsin

MeSH: Amantadine

MeSH: Hemagglutination Inhibition Tests

MeSH: Orthomyxoviridae

MeSH: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

Abstract: Influenza virus is a negative-sense segmented RNA virus belonging to the family of Orthomyxoviridae. The circulating human influenza viruses i.e., influenza A virus (subtype H1, H3) and influenza B virus can be identified by multiplex RT-PCR which is specific to the hemagglutinin (HA) genes. The amplified products of influenza A virus subtype H1, H3 and influenza B virus were 944 bp, 591 bp and 767 bp, respectively. The objectives of this study were: 1) To evaluate the multiplex RTPCR method for detection influenza A virus (H1, H3) and influenza B virus from clinical specimens; 2) To study influenza virus types and subtypes in patients with acute upper respiratory tract infection by isolation and multiplex RT-PCR; 3) To determine sensitivity and specificity of multiplex RT-PCR in comparison to isolation; 4) To study the susceptibility of influenza virus reference strains to amantadine by hemagglutination inhibition assay. Sensitivity of multiplex RT-PCR for detection of influenza A/New Caledonia/20/99 (H1N1)-like virus, A/Moscow/10/99 (H3N2)-like virus and B/Hong Kong/330/2001-like virus were 10 HAU/reaction for each strain. Multiplex RT-PCR was used to detect influenza virus in 221 throat swab samples collected from Out-patients with acute upper respiratory tract infection during May 2002 to March 2003 at Health Center 17, Bangkok and Clinic of Department of Pediatric, Siriraj Hospital. Of 221 throat swab samples, 50 (22.62%) were found positive for influenza viruses by multiplex RT-PCR. The detected influenza viruses were 45 (20.36%) influenza A viruses (H3) and 5 (2.26%) influenza B viruses. The isolation rate of influenza virus was 21.26% (47/221). The isolates were 30 (13.57%) A/Moscow/10/99 (H3N2)-like virus and 17 (7.69%) B/Hong Kong/330/2001-like virus. In comparison to isolation, sensitivity and specificity of multiplex RT-PCR for detection of influenza virus were 55.32% and 86.21%, respectively. The sensitivity and specificity of multiplex RT-PCR for detection of influenza A (H3N2) virus were 70% and 86.21%, respectively and for detection of influenza virus B was 29.41% and 100%, respectively. We conclude that multiplex RT-PCR can be used for detection, identification of type and subtype of human influenza viruses in respiratory samples. Multiplex RTPCR is a convenient, rapid and useful method for detecting the genome of replicative incompetent influenza viruses. Susceptibility of influenza virus to amantadine was performed by hemagglutination inhibition assay. The 50% cytotoxicity concentration (CC50) of amantadine was 174.65 μg/ml. Concentrations of 50 and 12.5 μg/ml were 100% inhibitory concentration (IC100) of amantadine to influenza A/New Caledonia/20/99 (H1N1)-like virus and A/Moscow/10/99 (H3N2)-like virus, respectively. Amantadine could not inhibit infectivity of influenza B virus. This preliminary study demonstrated that hemagglutination inhibition assay, a simple method, could be used for testing anti-influenza drug susceptibility.

Abstract: เชื้อไข้หวัดใหญ่เป็นไวรัสชนิดอาร์เอ็นเอ จัดอยู่ในสกุล Orthomyxoviridae ไวรัสไข้หวัดใหญ่ที่ระบาดใน คนในปัจจุบันคือไวรัสไข้หวัดใหญ่ชนิด A (H1, H3) และ B ซึ่งสามารถตรวจหาได้ด้วยวิธี multiplex RT-PCR โดยใช้ multiplex primers ที่จำเพาะต่อ hemagglutinin (HA) genes ซึ่ง amplified products ของไวรัสไข้หวัด ใหญ่ชนิด A (H1), A (H3) และ B มีขนาด 944 bp, 591 bp และ 767 bp ตามลำดับ การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์ คือ: 1) เพื่อประเมินหาวิธี multiplex RT-PCR สำหรับการตรวจหาไวรัสไข้หวัดใหญ่ชนิด A (H1, H3) และ B ในตัวอย่างตรวจ; 2)เพื่อศึกษาการติดเชื้อไวรัสไข้หวัดใหญ่ในผู้ป่วยที่ติดเชื้อทางเดินหายใจส่วนบนแบบเฉียบพลัน ด้วยวิธีแยกเชื้อในเซลล์เพาะเลี้ยงและ multiplex RT-PCR; 3) เพื่อหาความไวและความจำเพาะของวีธี multiplex RT-PCR เปรียบเทียบกับวีธีแยกเชื้อในเซลล์เพาะเลี้ยง; 4) เพื่อทดสอบความไวของไวรัสไข้หวัดใหญ่ต่อยา amantadine ด้วย hemagglutination inhibition assay (HI) Multiplex RT-PCR สามารถตรวจหาอาร์เอ็นเอของไวรัสไข้หวัดใหญ่ปริมาณต่ำสุดเท่ากับ 10 HAU/reaction ศึกษาตัวอย่างตรวจจากน้ำป้ายคอของผู้ป่วยที่ติดเชื้อทางเดินหายใจส่วนบนแบบเฉียบพลันในระหว่างเดือนพฤษภาคม 2545 ถึงเดือนมีนาคม 2546 โดยเก็บที่ศูนย์บริการสาธารณสุข 17 กรุงเทพมหานคร และที่โรงพยาบาลศิริราช จำนวน 221 ตัวอย่าง วิธี multiplex RT-PCR สามารถตรวจพบไวรัสไข้หวัดใหญ่ได้ 50 (22.62%) ตัวอย่าง โดย เป็นไวรัสไข้หวัดใหญ่ชนิด A (H3) 45 (20.36%) ตัวอย่าง และ B 5 (2.26%) ตัวอย่าง วิธีแยกเชื้อในเซลล์ เพาะเลี้ยงสามารถแยกเชื้อไวรัสไข้หวัดใหญ่ได้ 47 (21.26%) ตัวอย่าง เป็นไวรัสไข้หวัดใหญ่สายพันธุ์คล้าย A/Moscow/10/99 (H3N2) 30 (13.57%) ตัวอย่าง และสายพันธุ์คล้าย B/Hong Kong/330/2001 17 (7.69%) ตัวอย่าง วีธี multiplex RT-PCR เปรียบเทียบกับวีธีแยกเชื้อในเซลล์เพาะเลี้ยงซึ่งเป็นวิธีมาตราฐานในการตรวจหา ไวรัสไข้หวัดใหญ่พบว่า multiplex RT-PCR มีความไว 55.32% และความจำเพาะ 86.21% โดยความไวของการ ตรวจหาไวรัสไข้หวัดใหญ่ A เป็น 70% และความจำเพาะเท่ากับ 86.21% ส่วนไวรัสไข้หวัดใหญ่ B มีความไว 29.41% และความจำเพาะเท่ากับ 100% กล่าวโดยสรุป multiplex RT-PCR สามารถใช้จำแนก type และ subtype ของไวรัสไข้หวัดใหญ่ในตัวอย่างตรวจได้โดยตรง เป็นวิธีการที่สะดวก รวดเร็ว และเป็นประโยชน์ใน การตรวจหาสารพันธุกรรมของไวรัสไข้หวัดใหญ่ในตัวอย่างตรวจซึ่งมีไวรัสที่ไม่สามารถเพิ่มจำนวนได้ การหาความไวของไวรัสไข้หวัดใหญ่ต่อยา amantadine ด้วยวิธี HI พบว่าความเข้มข้นของยาที่สามารถ ทำลายเซลล์เพาะเลี้ยงได้ร้อยละ 50 (CC50) คือ 174.65 μg/ml ความเข้มข้นของยาที่ยับยั้งการติดเชื้อในเซลล์ เพาะเลี้ยงได้สมบูรณ์ (IC100) ของไวรัสไข้หวัดใหญ่สายพันธุ์คล้าย A/New Caledonia/20/99 (H1N1) และสาย พันธุ์คล้าย A/Moscow/10/99 (H3N2) เท่ากับ 50 และ 12.5 μg/ml ตามลำดับ ยานี้ไม่สามารถยับยั้งการติดเชื้อ ไวรัสไข้หวัดใหญ่ชนิด Bได้ HI เป็นวิธีที่ง่ายในการตรวจหาความไวของไวรัสไข้หวัดใหญ่ต่อยาต้านไวรัส

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Sontana Siritantikorn

Role: Thesis Advisors

Created: 2004

Modified: 2553-04-26

Issued: 2010-02-05

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740445608

CallNumber: TH T444m 2004

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Microbiology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4337138.pdf	947.09 KB	36	2023-12-14 13:26:04

ใช้เวลา

-0.777367 วินาที