The development and validation of Novel ELISA and real-time PCR plasmodium falciparum in vitro drug sensitivity assays

การพัฒนาและความน่าเชื่อถือของวิธี Novel ELISA และวิธี real-time PCR ในการทดสอบความไวของยารักษามาลาเรียชนิด plasmodium falciparum

Name: Pradist Kaewsatien

MeSH: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

MeSH: Microbial Sensitivity Tests

MeSH: Plasmodium falciparum

MeSH: Polymerase Chain Reaction

Abstract: Despite the best efforts of health authorities, malaria remains prevalent along the borders of Myanmar, Cambodia and Malaysia. The western part of Tak province Thailand, which borders on eastern Myanmar, is endemic for multiple drug resistant Plasmodium falciparum. In recent years there has been a concerted effort to develop quantitative in vitro assay methods based on Quantitative Real-Time PCR (QRT-PCR) and ELISA technologies such as the HRP-2 and DELI (pLDH) assays. These methodologies are very sensitive and avoid the subjectivity of the WHO micro test assay. This thesis had two specific objectives; firstly to determine the EC50 and MIC of chloroquine and mefloquine in isolates of P. falciparum. Secondly, to compare the in vitro drug sensitivity of P. falciparum isolates and clones collected using the standard WHO microtest, HRP-2 assay and QRT-PCR. The study was conducted from September 2003 to February 2004 at Mae-Sod, Tak province. Thirty four isolates of P. falciparum were selected from symptomatic malaria patients. A Blood RPMI Media Mixture (BMM) containing the P. falciparum isolates were loaded onto 96 well plates that were predosed with serial dilutions of chloroquine (1,062 ng/ml) and mefloquine(660 ng/ml). The plates containing the BBM were incubated in an oxygen reduced environment at 37oC for up to 72hrs. The growth of the parasites in the drug treatments was measured by WHO micro test, QRT-PCR, HRP-2 ELISA and DELI ELISA assays. Of the 34 Plasmodium isolates in excess of 1,000 – 80,000 parasites/μl successfully assayed 100% were resistant to chloroquine, with a median MIC of 330 ng/ml and mean EC50 of 168 ng/ml. In contrast only 15% were resistant to mefloquine, with a median MIC of 133 ng/ml and mean EC50 of 675 ng/ml. The comparison of the three in vitro drug sensitivity assays showed no significant difference between the WHO micro test and QRT-PCR assay. Although the HRP-2 assay performed poorly in the first set of experiments, increasing the volume of BMM in subsequent experiments greatly improved the results from the ELISA bases assay. Our study also showed that there is no significant difference between the sensitivity data collected from P. falciparum using either the HRP-2 or DELI ELISA assays. However the HRP-2 assay is quicker to use and is commercially available, thus eliminating the need to quality assurance each batch of ELISA plates used. While the QRT-PCR method is both accurate and precise, it is very expensive and skilled labor intensive, suggesting that this technique is more suitable for reference laboratories and not routine testing of field isolates. The WHO microtest and the HRP-2 are both useful assays and relatively inexpensive assays for field malaria research in Thailand

Abstract: ปัญหาการดื้อยาของเชื้อ Plasmodium falciparum เป็นปัญหาสำคัญของประเทศไทย จังหวัดตากมีบริเวณ ติดชายแดนพม่า มักพบเชื้อ P. falciparum ดื้อต่อยาหลายชนิด การพัฒนาวิธีการศึกษาการดื้อยา ในหลอด ทดลองโดยวิธี Quantitative Real-Time PCR (QRT-PCR) , HRP-2 ELISA และ DELI (pLDH) ซึ่งเป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพสูง สามารถเปรียบเทียบกับวิธีมาตรฐาน WHO microtest วัตถุประสงค์ การวิจัย เป็นการเปรียบเทียบ วิธีการทดสอบการดื้อต่อยารักษาของเชื้อ P. falciparum ในยา Mefloquine และ Chloroquine 3 วิธี คือ Real-time PCR และ HRP-2 ELISA เปรียบเทียบกับวิธี WHO microtest ซึ่งประเมินจากค่า EC50 และ MIC โดยตัวอย่าง P. falciparum 34 ตัวอย่างที่แยกได้จากผู้ป่วยมาลาเรียที่ อาศัยอยู่ในอำเภอแม่สอด จังหวัดตาก ตั้งแต่เดือนกันยายน 2546 - กุมภาพันธ์ 2547 และตรวจพบจำนวนเชื้อ P. falciparum อยู่ระหว่าง 1,000-80,000 เซล/ไมโครลิตร ผลการศึกษาพบว่า 100% ดื้อต่อยารักษา Chloroquine ที่ MIC ค่าเฉลี่ย 330 นาโนกรัม/มิลลิลิตร และ EC50 ค่าเฉลี่ย 168 นาโนกรัม/มิลลิลิตร และ 15 % ดื้อต่อยารักษา Mefloquine ที่ MIC ค่าเฉลี่ย 133 นาโนกรัม/มิลลิลิตร และ EC50 ค่าเฉลี่ย 67.5 นาโนกรัม/มิลลิลิตร ผลจากการเปรียบเทียบวิธีการทดสอบทั้ง 3 วิธี พบว่า วิธี WHO microtest กับวิธี Real-Time PCR ไม่มีความแตกต่างกัน ส่วนวิธี HRP-2 ELISA มีความแตกต่างจากการศึกษาครั้งแรก (50 ไมโครลิตร) แต่เมื่อเพิ่มปริมาณ Blood Media Mixture (BMM) (200 ไมโครลิตร) ในขั้นตอนการ ศึกษาแล้วให้ผลการทดสอบดีขึ้น โดยเมื่อทดสอบความไวของเชื้อ P. falciparum ต่อยาทั้ง 2 ชนิดด้วยวิธี HRP-2 กับ DELI ELISA พบว่า ไม่มีความแตกต่างกัน ดังนั้น วิธีการทดสอบความไวของยาต่อเชื้อ P. falciparum ด้วยวิธี Real-Time PCR เป็นวิธีที่ให้ผลการทดสอบได้ถูกต้องและแม่นยำ แต่มีข้อจำกัด คือ มีต้นทุนสูงและต้องใช้บุคลากรที่มีความรู้ความชำนาญและประสบการณ์ในการตรวจ ดังนั้น วิธีนี้จึงเป็นวิธี ที่เหมาะสมสำหรับใช้ในการตรวจในห้องปฏิบัติการเพื่อยืนยันผล ส่วนวิธีการ WHO microtest และ HRP- 2 เป็นวิธีที่มีต้นทุนราคาในการทดสอบไม่แพงมาก และสะดวกจึงเหมาะและสามารถใช้ในการทดสอบความไว ต่อยาของเชื้อในพื้นที่ของประเทศไทย

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Usa Lek-Uthai

Role: Thesis Advisors

Created: 2004

Modified: 2553-06-26

Issued: 2010-02-02

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740444679

CallNumber: TH P896d 2004

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Infectious Diseases and Epidemiology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4536352.pdf	11.99 MB	41	2025-01-22 15:29:25

ใช้เวลา

0.325342 วินาที