Production of recombinant human 65-kDa glutamic acid decarboxylase ‪(GAD65)‬ for anti-GAD65 autoantibody detection by a signal amplification ELISA technique

การผลิต recombinant human glutamic acid decarboxylase ขนาด 65 กิโลดาลตัน ‪(GAD65)‬ เพื่อตรวจหา anti-GAD65 autoantibody โดยวิธี signal amplification ELISA technique

Name: Phanasit Poowasanpetch

MeSH: Allergy and Immunology

MeSH: Autoantibodies

MeSH: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

MeSH: Glutamic Acid

Abstract: Type one diabetes mellitus is a multifactorial disease in which certain unidentified genes and autoimmune destruction of the β-cells of the pancreas play a major causative role. Information regarding the 65-kDa glutamic acid decarboxylase (GAD65) antibody in patients’ serum may provide crucial information for proper diagnosis, estimation of disease progression, and development of appropriate treatment and prevention plans. Human GAD65 protein antigen fused with glutathione S-transferase (GST) was produced in this study. To detect anti-GAD65 autoantibody, we developed a signal amplification enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Sera from 21 type one diabetes patients and 15 normal subjects were subjected to anti-GAD65 autoantibody detection by the assay. Only one patient gave positive results of anti-GAD65 autoantibody detection while all normal subjects gave negative results. We investigated the causes of low sensitivity of the test and found that the high pH of coating buffer used was not the cause. According to western blot analysis, contamination by other proteins in the GAD65-GST fusion protein preparation was unlikely. Polysaccharide or lipopolysaccharide contamination, however, cannot be excluded; and the conformational structure of purified GAD65- GST antigen adsorbed to the wells was not investigated because other ELISA formats were required to test this. The preclinical or early phase of serum samples was required to investigate the last possible cause of the low sensitivity of the ELISA, as the level of autoantibody can decrease with time after onset of the disease. The successful production of large amount of GAD65-GST fusion protein has several applications such as use for the evaluation of T-cell response against GAD65 antigen in type one diabetes patients

Abstract: โรคเบาหวานชนิดที่ 1 เป็นโรคออโตอิมมูนซึ่งมีการทำลายเบตาเซลล์ของตับอ่อน เป็นผลให้มี แอนติเจนในเซลล์ตับอ่อนดังกล่าวถูกปลดปล่อยออกมา เช่น glutamic acid decarboxylase ขนาด 65 kDa (GAD65) การตรวจหาออโตแอนติบอดีต่อ GAD65 จะเป็นประโยชน์ต่อการวินิจฉัยโรค ติดตาม พัฒนาการของโรค การรักษาและการป้องกันโรค ในการศึกษานี้ผู้วิจัยได้ผลิต recombinant human GAD65 จาก Escherichia coli โดยโปรตีนแอนติเจนนี้จะเชื่อมต่อกับ glutathione S-transferase (GST) เป็น GAD65-GST และได้นำแอนติเจนดังกล่าวมาใช้ในการทดสอบวิธี signal amplification enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) เพื่อตรวจหาแอนติบอดีต่อแอนติเจน GAD65 เมื่อนำเทคนิคที่พัฒนาขึ้นมาตรวจซีรั่มจากผู้ป่วยเบาหวานชนิดที่ 1 จำนวน 21 ราย และคนปกติจำนวน 15 ราย พบว่าซีรั่มจากผู้ป่วยเพียง 1 รายให้ผลบวก ในขณะที่ซีรั่มจากคนปกติทุกรายให้ผลลบ ได้ทดสอบหาสาเหตุของ การที่ตรวจพบแอนติบอดีต่อ GAD65 ในซีรั่มของผู้ป่วยได้เพียงจำนวนน้อยราย พบว่าค่า pH ของน้ำยาที่ใช้ เคลือบแอนติเจนให้ยึดติดกับผิวพลาสติกไม่น่าจะเป็นสาเหตุ ไม่พบการปนเปื้อนของโปรตีนอื่นกับแอนติเจนที่ ผลิตขึ้น แต่ไม่ได้ทำการพิสูจน์เรื่องลักษณะของ GAD65-GST แอนติเจนที่อาจมีการเปลี่ยนรูปร่างไปหลังจาก ยึดเกาะกับผิวพลาสติกซึ่งอาจทำให้มีผลต่อการทดสอบ ทั้งนี้เนื่องจากต้องใช้วิธี ELISA รูปแบบอื่นจึงจะ สามารถพิสูจน์ได้ รวมทั้งเรื่องความเหมาะสมของซีรั่มที่ใช้ทดสอบซึ่งจะสามารถพิสูจน์ได้โดยการเก็บซีรั่ม ในช่วงก่อนหรือเพิ่งเป็นโรคมาใช้พิสูจน์สมมุติฐานนี้เพราะระดับแอนติบอดีอาจต่ำมากในซีรั่มของผู้ป่วยที่เป็น โรคมานานแล้ว นอกจากนั้นการประสบความสำเร็จในการผลิต GAD65-GST โปรตีนนั้นสามารถนำไปใช้ ประโยชน์หลายประการ เช่น นำมาใช้เป็นแอนติเจนในการตรวจดูการตอบสนองของ T-cell ต่อแอนติเจน GAD65 ในผู้ป่วยเบาหวานชนิดที่ 1

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Sunee Korbsrisate

Role: Thesis Advisors

Created: 2004

Modified: 2553-04-26

Issued: 2010-02-01

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740443451

CallNumber: TH P535p 2004

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Immunology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4436236.pdf	1.02 MB	11	2024-12-23 17:57:24

ใช้เวลา

0.31752 วินาที