Production of recombinant phytase in Pseudomonas putida carrying the Escherichia Coli gene ‪(appA)‬

การผลิตเอนไซม์ไฟเทสจาก Pseudomonas putida ที่มียีน appA จาก Escherichia coli

Name: Jetnapa Techawiparat

LCSH: Escherichia coli

LCSH: Pseudomonas

Abstract: Phytase is important for animal feed supplementation. Previous work showed that Escherichia coli K12 produced phytase but could not secrete it. Later, the gene coding for phytase was cloned and transformed into Pseudomonas putida which could secrete the enzyme and utilize simple materials as a nutrient source. Thus, it was necessary to find out the general properties of phytase and its digestion efficiency as well as the best developing medium. Pseudomonas putida carrying Escherichia coli gene (appA) [P(EappA)] was studied for extracellular phytase production. General properties of P(EappA) phytase were determined by using culture supernatant produced in Luria Bertani medium. Crude phytase was found to be most stable at pH 4 and 8 when stored for two hours at 4oC, and at pH 4 and 10 when stored at 37oC. It was most stable at 45oC. The optimal condition for its activity was obtained at pH 4, 55 oC. P(EappA) phytase was sensitive to trypsin, taurocholic acid, deoxycholic acid and propionic acid. Nonetheless, its activity was enhanced when stored with lactic acid. As to the effect of ions, P(EappA) phytase was stable when stored in Na+, K+, Mn2+ and Co+ but was not stable when stored in Ca2+, NH4 +, Cu2+, Fe2+ and Zn2+. In addition, the enzyme activity was enhanced when stored in Mg2+, although it was insensitive to EDTA. In developing the medium, P(EappA) phytase was found to be best produced in medium composed of Phytase Screening Medium with phytate omitted and supplemented with 10% soybean meal, 0.1% yeast extract and 0.1% citric acid. In preparation of this medium, glucose was added prior to sterilization. Cultivation of P(EappA) in 500-ml of this medium showed that P(EappA) growth entered log phase at 12 hours and reached maximum growth at the 18 hours with a growth rate at 0.1 OD600/hr. Phytase production was concomitant with growth with a rate at 6.32 U/hr. After 48 hours, the phytase activity obtained was 177.62 U/ml. The level of reducing sugar decreased slowly during the first 30 hours and then dropped rapidly when growth reached the stationary phase. The level of pH did not show vigorous change throughout the cultivation. P(EappA) also contained other enzyme activities: amylase, cellulase, xylanase and endoglucanase. P(EappA) phytase was concentrated and stored in three forms: solution, air-dried and wet precipitates, which retained ≥80% of activity after a 28-day storage. When each form of enzyme was mixed in chicken feed, the air-dried form was the most stable. As to digestion efficiency, the enzyme helped to increase the phosphate and protein contents in chicken feed, wheat bran and soybean meal but not in rice bran, while the level of reducing sugar contents in all materials tested did not significantly increase. Soymilk digestion under the condition used in this study was unsuccessful

Abstract: Pseudomonas putida ที่มียีน appA จาก Escherichia coli [P(EappA)] ผลิตเอนไซม์ ไฟเทสแบบ extracellular นำมาเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ LB เพื่อศึกษาคุณสมบัติเอนไซม์ ไฟเทส ของP(EappA) มีความคงทนต่อความเป็นกรดและด่างที่อุณหภูมิ 4oC ที่ pH 4 และ 8และเปลี่ยน ระดับความคงทนมาที่ pH 4 และ 10 ที่อุณหภูมิ 37oC และมีความคงทนสูงสุดที่อุณหภูมิ 45oC เอนไซม์มีประสิทธิภาพการทำงานสูงสุดที่ pH 4.5 และอุณหภูมิ 55oC ไฟเทสลดความคงทนใน สภาวะที่มี trypsin, taurocholic acid, deoxycholic acid และ propionic acid แต่คงทนใน สภาวะที่มี lactic acid ไฟเทสมีความคงทนในสภาวะที่มี Na+, K+, Mn2+ และ Co+แต่เสียความ คงทนเมื่อมี Ca2+, NH4 +, Cu2+, Fe2+ และ Zn2+ ส่วน Mg2+เพิ่มความสามารถการทำงานของ เอนไซม์และ EDTA ไม่มีผลกระทบต่อไฟเทส เมื่อพัฒนาสูตรอาหารพบว่าอาหารชนิด SMYC ประกอบด้วย ส่วนประกอบของ PSM (Kerovuo et al., 1998)ที่ไม่เติม phytate และเติม 10% กากถั่วเหลือง, 0.1% yeast extract และ 0.1% citric acidและเติมน้ำตาลกลูโคสก่อนฆ่าเชื้อให้ ความสามารถการทำงานของไฟเทสสูงสุด นำ SMYC 500 มิลลิลิตรมาเลี้ยง P(EappA)พบว่าใน 12 ชั่วโมงอัตราการเจริญเข้าสู่ log phaseและสู่จุดสูงสุดในชั่วโมงที่ 18โดยมีอัตราการเจริญเท่ากับ 0.1 OD600/hr และความสามารการทำงานที่ 6.32 U/ml เมื่อครบ 48 ชั่วโมงความสามารถการ ทำงานของเอนไซม์เท่ากับ 177.62 U/ml ปริมาณน้ำตาลรีดิวซิ่งลดลงอย่างช้าใน 30 ชั่วโมงแรกและ ลดอย่างรวดเร็วเมื่อเข้าสู่ stationary phase ส่วนค่า pH ไม่มีการเปลี่ยนแปลง ใน P(EappA)พบ เอนไซม์ชนิดอื่นเช่น amylase, cellulase, xylanase และ endoglucanase ทำไฟเทสให้เข้มข้น และเก็บในรูปของสารละลาย, ตะกอนแห้ง และตะกอนเปียกพบว่าทั้งสามชนิดมีความสามารถการ ทำงานคงเหลือมากกว่า 80%หลังจากเก็บ 28 วันและเอนไซม์ชนิดตะกอนแห้งมีความคงทนสูงสุด เมื่อผสมกับอาหารสัตว์ ประสิทธิภาพการย่อยโดยไฟเทสเพิ่มปริมาณฟอสเฟตและโปรตีนในอาหาร เลี้ยงไก่, รำข้าวสาลี และกากถั่วเหลืองแต่ไม่พบในรำข้าวเจ้า ส่วนปริมาณน้ำตาลรีดิวซิ่งไม่เพิ่มขึ้น อย่างมีนัยสำคัญ การย่อยน้ำนมถั่วเหลืองของการศึกษานี้ไม่ประสบผลสำเร็จ

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Saovanee Dharmsthiti

Role: Thesis Advisors

Created: 2003

Modified: 2553-03-11

Issued: 2010-01-26

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740442234

CallNumber: TH J58p 2003

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Biotechnology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4436699.pdf	731.89 KB	22	2018-05-29 02:25:59

ใช้เวลา

0.207633 วินาที