Study of a novel β-glucosidase from Thai plants

การศึกษาเอ็นไซม์เบต้ากลูโคซิเดสชนิดใหม่จากพืชในประเทศไทย

Name: Doungkamol Boonclarm

LCSH: Glucosidases

LCSH: Glucosides

LCSH: Plumeria

Abstract: β-glucosidases (EC 3.2.1.21) are a group of glycosidase enzymes ( EC 3.2 ) that catalyze the hydrolysis of β-glucosidic linkages formed between D-glucose and the hydroxyl group of other compounds (aglycone or another glycone). These enzymes have potential applications for the sequence determination of oligosaccharides, as well as for oligosaccharide or glycoside synthesis by reverse hydrolysis or transglucosylation. We have used these enzymes (Thai rosewood, almond or cassava stem β-glucosidase) to screen for natural β-glucosides in 15 plant species. The ethanol extract of plant tissues were incubated in the presence or absence of enzyme, and the products separated by TLC, followed by detection under UV or spraying with 10% H2SO4 in absolute ethanol. The results showed that β-glucosides were found in many plants especially in Plumeria obtusa Linn, Plumeria rubra Linn and Murraya paniculata Jack. In addition, β-glucosidases were also screened for by using its crude substrate and other substrates e.g. arbutin and pNP-Glc. The results show that the crude enzyme from Plumeria obtusa Linn contains hydrolytic activity to its crude substrate and pNP-Glc. Subsequently, a β-glucosidase was purified from the flowers Plumeria obtusa Linn by DEAE-Cellulose, Con A-Sepharose, Sephacryl S-300 and Butyl-Sepharose chromatography. The cumulative yield and fold purification of the β- glucosidase were 2.3 % and 143 fold, respectively. The enzyme has a molecular weight of 180,000 in the native state, and shows 2 bands of 59,000 kDa and 67,000 kDa in the denatured state. One fluorescent band of β-glucosidase was found with pI about 5.0 by agarose gel electrophoresis. The optimum pH of the purified β- glucosidase detected by pNP-Glc and its natural substrate was 5.5. The Km value for pNP-Glc and Plumeria β-glucoside were 2.9 and 0.33 mM, respectively. The enzyme had hydrolytic activity towards pNP-β-Glc, pNP-β-Fuc, pNP-β-Gal and pNP-β-Man, and had lower activity for other pNP-glycosides, dalcochinin-β-glucoside (the natural substrate of Thai Rosewood β-glucosidase) and esculin, The enzyme could not hydrolyze cyanogenic glucoside (prunasin, linamarin and amygdalin), the natural substrate of Solanum torvum (torvoside H), disaccharides (gentiobiose), aromatic glucosides (arbutin and salicin) and alkyl glucosides (methyl-glucosides and hexylglucosides). The natural substrate of β-glucosidase from the flowers of Plumeria obtusa Linn was isolated and identified. Structure elucidation of the compound was established by NMR spectroscopic data. It is a known iridoid glucoside, namely plumieride coumarate glucoside

Abstract: เบต้ากลูโคซิเดสเป็นเอ็นไซม์ที่ย่อยพันธะเบต้ากลูโคซิดิคระหว่างน้ำตาลกลูโคสกับน้ำตาล ตัวอื่นๆหรือสารชนิดอื่น และยังสามารถใช้หาลำดับของโอลิโกแซคคาไรด์และสังเคราะห์โอลิโก แซคคาไรด์และไกลโคไซด์ด้วยปฏิกริยาไฮโดรไลสิสแบบย้อนกลับหรือปฏิกิริยาทรานกลูโคซิล เลชั่น นอกจากนี้ยังได้ใช้เอนไซม์ชนิดนี้ในการตรวจหาเบต้ากลูโคไซด์ในพืช 15 ชนิดโดยใช้ เอนไซม์สามชนิด คือ เบต้ากลูโคซิเดสจากพยูง อัลมอนด์ และต้นมันสำปะหลัง พบว่าในลั่นทม ขาว ลั่นทมแดงและแก้วมีปริมาณกลูโคไซด์ที่สามารถตรวจพบได้ นอกจากนี้ยังได้มีการตรวจหา เอนไซม์เบต้ากลูโคซิเดสโดยใช้สับเสรทสำหรับเอนไซม์นี้ในการตรวจหา พบว่าสารสกัดจากดอก ลั่นทมขาวสามารถย่อยสับสเตรทของตัวมันเองและ pNP-Glc ได้ด้วย แสดงให้เห็นว่ามีเอนไซม์ เบต้ากลูโคซิเดสและเบต้ากลูโคไซด์อยู่ในดอกลั่นทมขาว จากนั้นจึงทำการสกัดเอนไซม์เบต้ากลูโค ซิเดสจากดอกลั่นทมขาวโดยวิธีทางโครมาโตกราฟีโดยใช้ DEAE-Cellulose, Con ASepharose, Sephacryl S-300 และ Butyl-Sepharose คอลัมน์ จากขั้นตอนที่กล่าวมาพบว่า มี ปริมาณแอคติวิตี้ที่หลงเหลือเท่ากับ 2.3 เปอร์เซ็นต์ และมีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 143 เท่า ขนาด โมเลกุลของเอ็นไซม์ที่ได้จากคอลัมน์เซฟาคริล เอส-300 คือ 180 กิโลดาลตัน และพบว่ามีขนาด 59 และ 67 กิโลดาลตันบนอิเลคโตรโฟรีซีส เอ็นไซม์นี้มีค่า pI ประมาณ 5.0 และมีค่า pH ที่ให้ แอคติวิตี้ต่อ pNP-Glc และสับสเตรทธรรมชาติสูงสุด คือ 5.5 จากการศึกษาทางด้านจลศาสตร์ ของเอ็นไซม์ต่อ pNP-Glc และ สับสเตรทธรรมชาติได้ค่า Km เท่ากับ 2.9 และ 0.33 มิลลิโมลาร์ ตามลำดับ เอ็นไซม์นี้สามารถย่อย pNP-β-Glc, pNP-β-Fuc, pNP-β-Gal และ pNP-β-Man ในขณะที่ย่อย pNP-glycosides อื่นๆ ได้น้อยกว่า นอกจากนี้เอ็นไซม์ยังสามารถย่อย dalcochinin-β-glucoside และ esculin ได้ สับสเตรทธรรมชาติของเบต้ากลูโคซิเดสจากดอก ลั่นทมขาวได้ถูกแยกและศึกษาโครงสร้างโดยเทคนิคทาง NMR พบว่าเป็นกลูโคไซด์ที่จัดอยู่ใน พวก iridoid ที่มีชื่อว่า plumieride coumarate glucoside

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Jisnuson Svasti

Role: Thesis Advisors

Created: 2003

Modified: 2553-03-11

Issued: 2010-01-26

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740442145

TH D738s 2003

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Biochemistry

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4336154.pdf	1.91 MB	43	2022-11-30 09:19:45

ใช้เวลา

0.258687 วินาที