Cloning and expression of the oxygenase component of para-hydroxyphenylacetate hydroxylase

การโคลนและการแสดงออกของยีนออกซิเจนเนสของเอนไซม์พาราไฮดรอกซีฟีนิลอะซิเตตไฮดรอกซีเลส

Name: Kittisak Thotsaporn

LCSH: Flavoproteins

LCSH: Molecular cloning

LCSH: Oxygenases

Abstract: p-Hydroxyphenylacetate Hydroxylase (HPAH) found in Acinetobacter baumannii has been reported as a two-component monooxygenase enzyme that catalyzes the conversion of p-hydroxyphenylacetate (HPA) to 3,4- dihydroxyphenylacetate (DHPA). A Previous study has shown that a reductase (Component 1; C1) supplied the reduced flavin to an oxygenase (Component 2; C2) and C2 hydroxylated HPA by using reduced flavin and oxygen. In this study, the gene encoding C2 component of HPAH from A. baumannii was identified, cloned, and expressed. A 102 base-pair DNA fragment corresponding to the N-terminal sequence of C2 was used as a probe to screen the genomic DNA library of A. baumannii for C2- hpah gene. We obtained a DNA fragment of 4.8 kilo-base containing 627 bp, which was identified as part of the C2-hpah gene. Using the N-terminal sequence of C1 to design PCR primers, results of PCR reactions demonstrated that C2-hpah gene was upstream of the C1-hpah gene. The rest of the C2-hpah gene was identified by using the other probe corresponding to the N-terminal sequence of C1 protein. The deduced amino acid sequence of the C2 demonstrated that its structure was quite distinct from the enzyme in the same class of two-component aromatic flavorotein hydroxylase. The C2-hpah gene was overexpressed as a soluble protein in E.coli upon induction with 1 mM IPTG at 25 °C and purified to homogeneity. Properties including subunit molecular mass, specific activity, and kinetic constants showed that the properties of the recombinant enzyme were same as those of the native one.

Abstract: จากการศึกษาก่อนหน้าพบว่า p-Hydroxyphenylacetate Hydroxylase (HPAH) ที่พบในเชื้อ แบคทีเรีย Acinetobacter baumannii เป็นเอนไซม์ในกลุ่มโมโนออกซีจีเนส ที่สามารถย่อยสลายสาร phydroxyphenylacetate (HPA) แล้วได้ 3,4-dihydroxyphenylacetate (DHPA) เป็นผลิตภัณฑ์ เอนไซม์ตัวนี้ประกอบไปด้วยโปรตีน 2 ส่วน (two-component monooxygenase enzyme) คือ ส่วนที่เร่ง ปฏิกิริยารีดักชั่น (reductase component; C1) และส่วนที่เร่งปฏิกิริยาไฮดรอกซีเลชั่น (hydroxylase component; C2) การศึกษาในงานวิทยานิพนธ์นี้ได้ทำ การโคลนยีน และทำ การแสดงออกของยีนในส่วนที่เร่ง ปฏิกิริยาไฮดรอกซีเลชันของเอนไซม์นี้จากเชื้อ A. baumannii จากการทดลองได้สร้าง genomic library ของเชื้อ A. baumannii และทำ การคัดเลือกยีนของเอนไซม์ด้วย probe ที่ได้จากการทำ PCR โดยใช้ primers ที่ออกแบบจากลำ ดับกรดอะมิโนที่ปลาย N-terminus ของ C2 พบว่าได้ยีนที่แสดงออก C2 เพียง 674 คู่เบส และจากข้อมูลของลำ ดับกรดอะมิโนของ C1 และจากการทำ PCR พบว่า ยีน C2 จะวางตัวอยู่เหนือขึ้น (upstream) ไปจากยีน C1 ดังนั้น ส่วนที่เหลือของยีน C2 ได้ทำ การคัดเลือกใหม่โดยใช้ probe ที่ได้จากการทำ PCR โดยใช้ primers ที่ออกแบบจากลำ ดับกรดอะมิโนที่ปลาย N-terminus ของ C1 จากการทำ library screening พบว่าได้ส่วนที่เหลือของยีน C2 จำ นวน 595 คู่เบส จากการหาลำ ดับนิวคลีโอไทด์ของยีน C2 ทั้ง หมด พบว่ายีน C2 มีขนาด 1446 คู่เบส สำ หรับสร้างกรดอะมิโนจำ นวน 422 ตัว เมื่อทำ การศึกษาเปรียบเทียบ ลำ ดับกรดอะมิโน พบว่ามีแตกต่างกับเอนไซม์ตัวอื่นๆในตระกูลเดียวกัน จากนั้นได้ทำ การแสดงออกของยีน C2 ใน E.coli ใต้สภาวะที่จำ เพาะ โดยทำ การเลี้ยงเชื้อที่อุณหภูมิ 25 °C ในสภาวะที่มีสารกระตุ้นการแสดงออกของ ยีน เอนไซม์ที่ได้ถูกแยกทำ ให้บริสุทธิ์ พบว่ามีคุณสมบัติทางจลนศาสตร์ของเอนไซม์เหมือนกับเอนไซม์ที่ได้จาก เชื้อ A. baumannii.

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Pimchai Chaiyen

Role: Thesis Advisors

Created: 2003

Modified: 2553-03-05

Issued: 2010-01-08

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740441289

CallNumber: TH K62c 2003

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Biochemistry

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4336158.pdf	1.47 MB	12	2021-02-12 20:46:35

ใช้เวลา

0.244284 วินาที