Detection and differentiation of pathogenic and non-pathogenic Leptospira species by polymerase chain reaction

การตรวจหาและการจำแนกเชื้อเลปโตสไปร่าชนิดก่อโรคและไม่ก่อโรคโดยวิธีการปฏิกริยาลูกโซ่

Name: Songsak Rugsasuk

MeSH: Leptospira -- pathologenicity

MeSH: Polymerase Chain Reaction

Abstract: Leptospirosis, a zoonotic disease with worldwide distribution, is caused by pathogenic Leptospira species. The spectrum of human disease caused by leptospires is extremely wide, ranging from subclinical infection to severe syndrome. Clinical diagnosis of leptospirosis is nonspecific. The direct methods of diagnosis (microscopic examination and cultivation) are important but limited. The serological testings require the time of rising antibodies. The objectives of this study were to develop PCR for diagnosing leptospiral infection and differentiate pathogenic and non-pathogenic leptospires in one tube of PCR, to determine analytical sensitivity and specificity of PCR assay, and to evaluate the sensitivity and specificity of the PCR using isolation as a gold standard. In addition, the objective of this study was to compare three methods of QIAamp® DNA mini kit, DNAzol solution treatment, and boiling used to extract Leptospira DNA from culture and kidney. Twenty-three serovars of pathogenic leptospires (australis, autumnalis, ballum, bangkok, bataviae, bratislarva, canicola, celledoni, copenhegeni, djasiman, grippotyphosa, hardjo, hebdomadis, icterohaemorrhage, javanica, pomona, pyrogenes, rachamati, saigon, sarmin, sejroe, tarassovi, and wolffi) and one non-pathogenic serovar (patoc) were used as references in a single PCR reaction containing three oligonucleotide primers whereby each primer was specific to 23s rDNA of leptospires. These primer sets could detected leptospiral DNA in rat kidney with positive isolation and amplified 615 bp for pathogenic leptospires and 316 bp for non-pathogenic leptospires. PCR products of pathogenic or non-pathogenic serovars was confirmed by digestion with restriction enzyme SacI or PstI. Analytical sensitivity of PCR were tested by dilution of leptospires and specificity of PCR were tested with other bacteria. To evaluate sensitivity, specificity, positive and negative predictive value of PCR test for detecting Leptospira DNA in rat kidneys were performed by known result of Leptospira isolation in rat kidney specimens was used as a gold standard. It was found that the positive results of PCR in pathogenic and non-pathogenic serovars of leptospires were 615 bp and 316 bp, respectively. The PCR assay could detect 10 cells of leptospires and did not amplify DNA from most tested bacteria showing the same size products of pathogenic or non-pathogenic leptospires. Sensitivity, specificity, positive and negative predictive value of this PCR in rat kidney samples using isolation as gold standard, were 94.5%, 100%, 100% and 92.6%,. From 3 extraction methods for this PCR, the highest sensitivity were obtained from DNA extracted by QIAamp® DNA mini kit (10cells/assay), boiling (40 cells/assay) and DNAzol solution (100 cells/assay), respectively. Likewise the DNA that extracted from positive Leptospira isolation rat kidney samples by QIAamp® DNA mini kit and DNAzol solution the highest sensitivity of detection was obtain from QIAamp® DNA mini kit. The high sensitivity and specificity of this new PCR assay for detecting leptospiral DNA in kidney from rats were demonstrated. The assay may be useful as diagnostic tool for leptospirosis cases.

Abstract: เลปโตสไปโรซิสเป็นโรคที่พบว่ามีการระบาดไปทั่วโลกโดยมีสัตว์เป็นพาหะ สาเหตุของโรคเกิดจากเชื้อ Leptospira ชนิดที่ก่อโรค ลักษณะอาการของโรคพบตั้งแต่ไม่แสดงอาการถึงอาการขั้นรุนแรง การวินิจฉัยโรค จากอาการยังไม่แน่ชัดเนื่องจากอาการคล้ายกับโรคอื่นๆ การวินิจฉัยโรคเลปโตสไปโรซิสโดยวิธีการตรวจหา เชื้อโดยตรงจากตัวอย่างตรวจและการเพาะแยกเชื้อ เป็นวิธีที่สำคัญแต่ยังมีข้อจำกัดหลายประการ วิธีการ ตรวจหาแอนติบอดีเป็นวิธีที่ช้าเนื่องจากต้องการเวลาที่ระดับแอนติบอดีเกิดขึ้น วัตถุประสงค์ของการศึกษาคือ พัฒนาวิธีการ PCR ในการวินิจฉัยโรคเลปโตสไปโรซิส และ จำแนกระหว่างเชื้อ Leptospira ที่ก่อโรคและไม่ก่อ โรค โดยการหาปริมาณเชื้อต่ำสุดที่วิธีการนี้สามารถตรวจพบได้ การหาความจำเพาะของ PCR โดยทดสอบกับ แบคทีเรียในกลุ่มอื่นๆ, หาความไวและความจำเพาะของวิธีการโดยใช้ผลการเพาะแยกเชื้อมาเป็นวิธีการ มาตรฐาน นอกจากนี้ได้ทำการเปรียบเทียบ 3 วิธี ที่ใช้ในการสกัด DNA ของเชื้ออ้างอิงและในไตหนู เชื้อ Leptospira ประกอบด้วยเชื้อก่อโรค 23 serovars (australis, autumnalis, ballum, bangkok, bataviae, bratisslava, canicola, celledoni, copenhegeni, djasiman, grippotyphosa, hardjo, hebdomadis, icterohaemorrhage, javanica, pomona, pyrogenes, rachamati, saigon, sarmin, sejroe, tarassovi, and wolffi) และไม่ก่อโรค 1 serovar (patoc) ผลของการศึกษาได้คัดเลือก primers จากตำแหน่ง 23S rRNA ยีนส์ของ Leptospira ซึ่งสามารถ ขยายจำนวน DNA ได้ product ขนาด 615 bp สำหรับเชื้อ Leptospira ที่ก่อโรค และ 316 bp สำหรับเชื้อที่ไม่ก่อโรค โดยการยืนยันผลของ products ด้วยการตัดด้วย เอ็นไซม์ตัดจำเพาะ Sac I และ Pst I ตามลำดับ การหาปริมาณเชื้อต่ำสุดที่วิธีการนี้ทำการทดสอบในเชื้อที่หลายระดับความเข้มข้นและหา ความจำเพาะของ PCR โดยทดสอบกับแบคทีเรียในกลุ่มอื่นๆ การหาความไว และความจำเพาะของวิธีการ รวมทั้ง การประเมินค่าความน่าเชื่อถือของผลการทดสอบ โดยใช้ DNA จากไตหนูที่รู้ผลของการเพาะแยกเชื้อ แล้ว มาเป็นวิธีการมาตรฐาน จากการศึกษาพบว่า วิธีการที่พัฒนาขึ้นนี้ สามารถที่จะจำแนกระหว่างเชื้อ Leptospira ที่ก่อโรคและไม่ก่อ โรคได้ โดยให้ความแตกต่างในขนาดของ DNA ที่ทำการขยายขึ้น (615 bp และ 316 bp ตามลำดับ) ปริมาณเชื้อ ต่ำสุดที่วิธีการนี้สามารถตรวจจับได้อยู่ที่ 10 เซลล์ วิธีการนี้ไม่สามารถขยาย DNA จากแบคทีเรียกลุ่มอื่นๆ ให้มี ขนาดเท่ากับเชื้อ Leptospira ความไว ความจำเพาะ และค่าความน่าเชื่อถือของผลการทดสอบ โดยใช้ผลการ เพาะแยกเชื้อมาเป็นวิธีการมาตรฐานอยู่ที่ 94.5, 100 %, 100% และ 92.6% ตามลำดับ นอกจากนี้ได้ทำการ เปรียบเทียบวิธีการสกัด DNA จากเชื้อที่เพาะเลี้ยง 3 วิธี พบว่า QIAamp® DNA mini kit ให้ผลความไวในการ ตรวจหาเชื้อคือ 10 เซลล์ รองลงมาคือ การต้ม 40 เซลล์ และ DNAzol solution 100 เซลล์ ส่วนการเปรียบเทียบ วิธีการสกัด DNA จากเชื้อในไตหนู 2 วิธี พบว่า QIAamp® DNA mini kit ให้ผลดีกว่า DNAzol solution จากการศึกษานี้พบว่า PCR ที่พัฒนามีความไวและความจำเพาะสูง ซึ่งเหมาะสมที่จะนำไปใช้ในการ วินิจฉัยโรคเลปโตสไปโรซิส

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Uraiwan Kositanont

Role: Thesis Advisors

Created: 2003

Modified: 2553-03-05

Issued: 2010-01-07

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740439772

CallNumber: TH S698d 2003

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Microbiology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4337137.pdf	2.33 MB	20	2024-12-01 19:29:08

ใช้เวลา

0.3215 วินาที