Correction of aberrant splicing of thalassemic β-globin pre-mRNA by antisense oligonucleotides

การแก้ไขการตัดต่อแบบผิดปกติของสาย β-globin pre mRNA ในโรคเบต้าธาลัสซีเมียโดยการใช้สาย antisense oligonucleotide

Name: Thipparat Suwanmanee

LCSH: Oligonucleotides

LCSH: Thalassemia

Abstract: A number of common mutations alter splicing patterns of the β-globin premRNA by creating aberrant splice sites. This defect in splicing results in a deficiency of β-globin mRNA and subsequently β-globin protein. It has been shown that masking of the abnormal splice site with antisense oligonucleotides can force the spliceosome to reselect the correct splice sites, resulting in a shift of abnormal to correct splicing pattern. Previous studies were carried out in IVS1-110, IVS2-654, -705 and -745 mutations that induce aberrant splice sites in intron of the β-globin pre-mRNA. In this study, I investigated the possibility of the use of the antisense oligonucleotide to target the cryptic splice site in exon 1 of the βΕ-globin pre-mRNA. The results showed that the oligonucleotide targeted to a cryptic splice site at nucleotide 127 (codon 25) in exon 1 of the βΕ-globin pre-mRNA activated by the ΗbE mutation effectively restored correctly spliced βΕ-globin mRNA and βΕ-globin in the HeLa cell line model that expressed human β-globin gene with a double βΕ/IVS1-6 mutation. Moreover, an increase in the levels of correctly spliced βΕ-globin mRNA and hemoglobin E was observed in oligonucleotide-treated erythroid precursor cells from thalassemic patients carrying the ΗbE mutation. The results indicated the therapeutic potential of oligonucleotides in repairing the splicing caused by both intronic and exonic aberrant splice sites. The same oligonucleotide was used to suppress the aberrant splice site at nucleotide 127 (codon 25) activated in pre-mRNAs carrying single mutations, βΕ , IVS1-5 and -6. The results showed that the oligonucleotide could suppress abnormal splicing and reduce the amount of aberrantly spliced mRNAs in both IVS1-5 and -6. This study revealed the advantage of targeting a common aberrant splice site created by several mutations with a single oligonucleotide. Note that a double mutation, βΕ/IVS1-5, was too strong to be repaired, therefore, the oligonucleotide was ineffective in modifying its splicing pathway. The above results have been obtained by delivering the oligonucleotides with a scrape or syringe loading technique. Subsequently, I was able to demonstrate that a neutral, morpholino oligonucleotide, could be effectively delivered into erythroid cells by free uptake. This treatment resulted in a high level of correct β-globin mRNA and hemoglobin A in erythroid cells from thalassemic patients with the IVS2-654/HbE genotype. To lay a foundation for future in vivo studies, the oligonucleotides were tested on bone marrow cells from transgenic mice carrying the human gene with β- globin IVS2-654 splice mutation. The results showed that free delivery of antisense oligonucleotide could effectively restore correctly spliced human β-globin mRNA, not only in cell lines and human erythroid precursor cells but also in murine bone marrow cells. The thalassemic animal will serve as a model for studies of pharmacological properties of the anitsense oligonucleotides. Overall the results presented here indicate that the antisense technology may be useful for treatment of β-thalassemia and possibly other disorders

Abstract: โรคเบต้าธาลัสซีเมียส่วนใหญ่เกิดจากการผ่าเหล่า การผ่าเหล่าหลายชนิดเป็นสาเหตุให้การตัด ต่อสายเบต้าโกลบิน mRNA เป็นไปในแบบที่ผิดปกติ ทำให้ได้สายเบต้าโกลบิน mRNA ที่ไม่สมบูรณ์ ไม่สามารถเป็นต้นแบบในการสร้างสายเบต้าโกลบินได้ การศึกษาวิจัยโดย Kole และคณะ แสดงให้ เห็นว่า antisense oligonucleotide สามารถเหนี่ยวนำให้การตัดต่อสายเบต้าโกลบิน mRNA เป็นไป ในแบบที่ปกติ และช่วยเพิ่มปริมาณการสร้างสายเบต้าโกลบิน และฮีโมโกลบิน โดยการศึกษาวิจัยดัง กล่าว เป็นการพยายามดัดแปลงทิศทางการตัดต่อสายเบต้าโกลบิน pre-mRNA ในเบต้าธาลัสซีเมีย ชนิด IVS1-110, IVS2-654, -705 และ -745 ซึ่งล้วนเป็นการผ่าเหล่าชนิดที่ก่อให้เกิดจุดตัดที่ผิดปกติ ในส่วนของชิ้นยีนที่ไม่ถูกใช้ในการแสดงออก (noncoding sequence) การใช้ antisense oligomer ไปยับยั้งจุดตัดที่ผิดปกติในบริเวณดังกล่าว จึงไม่ต้องกังวลว่า oligonucleotide จะยับยั้งการสร้างสาย เบต้าโกลบิน การศึกษาวิจัยในส่วนที่ 1 ของวิทยานิพนธ์เล่มนี้ มุ่งเน้นการใช้ antisense oligonucleotide ในการยับยั้งการใช้จุดตัดที่ผิดปกติที่อยู่ในส่วนของชิ้นยีนที่ถูกใช้ในการแสดงออก (coding sequence) ผลการทดลองปรากฏว่า oligonucleotide สามารถช่วยยับยั้งการใช้จุดตัดที่ผิด ปกติดังกล่าว ส่งผลให้มีการสร้างสายเบต้าโกลบิน mRNA ที่มีการตัดต่ออย่างถูกต้อง และสายโปรตีน เบต้าโกลบิน ทั้งในเซลล์ HeLa ชนิด βE /IVS1-6 และในเซลล์เม็ดเลือดแดงตัวอ่อนเพาะเลี้ยง ของผู้ ป่วยเบต้าธาลัสซีเมียที่มีจุดผ่าเหล่าชนิด HbE βE, IVS1-5 และ -6 ก่อให้เกิดจุดตัดร่วมที่ผิดปกติที่ตำแหน่งเบส 127 (codon 25) ในสาย เบต้าโกลบิน pre-mRNA การศึกษาวิจัยในส่วนที่ 2 จึงเน้นการใช้ antisense oligonucleotide ที่ให้ ผลดีในการแก้ไขการตัดต่อที่ผิดปกติของสายเบต้าโกลบิน mRNA ในเซลล์ HeLa ชนิด βE /IVS1-6 มารักษาเซลล์ HeLa ชนิด IVS1-5, βE /IVS1-5 และ -6 ผลการทดลอง ในเซลล์ HeLa ชนิด IVS1- 5 และ -6 ปรากฏว่า oligonucleotide ช่วยยับยั้งการตัดต่อที่เป็นแบบผิดปกติ ส่งผลให้ปริมาณสายเบ ต้าโกลบิน mRNA ที่มีการตัดต่ออย่างผิดปกติลดลง แต่ antisense oligonucleotide ข้างต้นไม่ สามารถเปลี่ยนแปลงการตัดต่อแบบผิดปกติของสายเบต้าโกลบิน mRNA ในเซลล์ HeLa ชนิด βE /IVS1-5 ได้ อุปสรรคที่สำคัญของการใช้ antisense oligonucleotide ในทางการแพทย์ คือ การขนส่ง และลำเลียง antisense oligonucleotide ไปยังเซลล์เป้าหมายที่ต้องการ การนำ morpholino oligonucleotide ซึ่งไม่มีประจุ เข้าสู่เซลล์ ต้องทำให้เยื่อหุ้มเซลล์มีรอยฉีกขาดด้วยอุปกรณ์ขูดเซลล์ ซึ่ง เป็นวิธีที่ไม่สามารถใช้ได้ในการรักษาผู้ป่วยในอนาคต การศึกษาวิจัยในส่วนที่ 3 ค้นพบว่า morpholino สามารถผ่านเข้าเยื่อหุ้มเซลล์เม็ดเลือดแดงตัวอ่อนเพาะเลี้ยง ของผู้ป่วยเบต้าธาลัสซีเมียที่มี จุดผ่าเหล่าในตำแหน่ง IVS2-654 ทำให้ได้สายเบต้าโกลบิน mRNA ที่มีการตัดต่อที่ถูกต้อง รวมทั้ง ฮีโมโกลบินเอ การศึกษาประสิทธิภาพการทำงานของ oligonucleotide ในเซลล์ไขกระดูกหนูที่เป็นเบ ต้าธาลัสซีเมียชนิด IVS2-654 แสดงให้เห็นว่า oligonucleotide ช่วยเพิ่มการสร้างสายเบต้าโกลบิน mRNA ที่มีการตัดต่อที่ถูกต้องเช่นกัน

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Suthat Fucharoen

Role: Thesis Advisors

Created: 2003

Modified: 2556-06-18

Issued: 2010-01-05

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740439934

CallNumber: TH T444c 2003

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Molecular Genetics and Genetic Engineering

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4136306.pdf	40 MB	3	2018-05-29 02:07:02
2	4136306-eng.pdf	1.39 MB	3	2018-05-29 02:07:10
3	4136306-tha.pdf	1.35 MB	4	2018-05-29 02:07:10

ใช้เวลา

0.25076 วินาที