Purification and characterization of B-Glucosidase and its natural substrates from Solanum torvum Sw.

การทำบริสุทธิ์และศึกษาคุณลักษณะของเอนไซม์เบต้า-กลูโคซิเดสและสับสเตรทธรรมชาติ จากต้นมะเขือพวง

Name: Dumrongkiet Arthan

MeSH: beta-Glucosidase

MeSH: Solanum -- enzymology

Abstract: This research was designed to purify and characterize β-glucosidase and the natural substrates for its hydrolysis in Solanum torvum Sw. The isolation from a MeOH extract of Solanum torvum Sw fruits for β-glucosidase hydrolysis yielded the two natural substrates − a new steroidal glycoside, torvoside H, together with the known glycoside, torvoside A − as well as a new C-4 sulfated isoflavonoid, torvanol A. Upon enzymatic hydrolysis with β-glucosidase, torvoside A, and torvoside H yielded the corresponding acetal derivatives, aglycone torvoside A and aglycone torvoside H, respectively. Torvanol A, torvoside H and aglycone torvoside H exhibited antiviral activity (herpes simplex virus type 1) with the IC50 values of 9.6, 23.2, and 17.4 μg/ml, respectively. β-Glucosidase was purified to homogeneity from young leaves of Solanum torvum Sw. The purified enzyme was highly specific for the cleavage of the glucose unit attached at the C-26 hydroxyl of torvoside A and H. Kinetic constants showed that Km values for torvoside A (63 μM) and torvoside H (68 μM) were lower than for the synthetic substrates, pNP-β-glucoside (1.03 mM) and 4- MU-β-glucoside (0.78 mM). The purified enzyme is monomeric with a native molecular weight of 87,000, a subunit molecular weight of 80,000, and a pI of 9.3 by chromatofocusing. The enzyme showed specificity only for the β-D glucosyl bond. Solanum β-glucosidase hydrolyzes torvosides and dalcochinin-8′-β-glucoside, the natural substrate of Thai rosewood β-glucosidase, but does not hydrolyze other natural substrates from β-glucosidases. Solanum β-glucosidase also hydrolyzes C5-C10 alkyl-β-glucosides, with rate of hydrolysis increasing with longer alkyl chain length. The internal amino acid sequences of Solanum β-glucosidase have a high similarity to the sequences of the family 3 β-glucosyl hydrolase.

Abstract: ได้ทำการศึกษาสับสเตรทธรรมชาติของเอนไซม์เบต้า-กลูโคซิเดสจากมะเขือพวง (Solanum torvum Sw) โดยนำสารสกัดเมธานอลจากผลมะเขือพวงมาทำการแยกบริสุทธิ์โดยเทคนิคโครมาโทกราฟีและศึกษาโครง สร้างทางเคมีโดยวิธีการทางเคมีและสเปกโทรสโกปี ได้สาร 2 ชนิด คือ torvoside A และ torvoside H ในระหว่างการทำบริสุทธิ์สับสเตรทธรรมชาติได้สารชนิดไหม่ทื่เป็นสาร isoflavonol sulphate (torvanol A) เมื่อนำสับสเตรทธรรมชาติทั้ง 2 ชนิดมาย่อยด้วยเอนไซม์เบต้า-กลูโคซิเดสจากต้นอัลมอนด์พบว่า ได้สาร อนุพันธ์คือ aglycone torvoside A และ aglycone torvoside H เมื่อนำสารบริสุทธิ์ที่ได้มาทั้งหมดมา ทดสอบฤทธิ์ทางชีวภาพพบว่า สาร torvanol A, torvoside H และ aglycone torvoside H มีฤิทธิ์ต้าน Hepes simplex virus type I โดยมืค่า IC50 เท่ากับ 9.6, 23.2 และ 17.4 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตรตาม ลำดับ เอนไซม์เบต้า-กลูโคซิเดส จากใบอ่อนต้นมะเขือพวงถูกทำให้บริสุทธิ์ โดยอาศัยกระบวนการ 6 ขั้นตอน ดังนี้ คือ การตกตะกอนด้วยเกลืออัมโมเนียมซัลเฟต 30 เปอร์เซนต์อิ่มตัว และการแยกด้วยคอลัมน์โครมาโตกรา ฟีของ Butyl-Toyopearl, ConA-Sepharose, CM-Accell, Sephacryl S-300 และ Butyl- Sepharose FF จากการทำให้บริสุทธิ์โดยขั้นตอนทั้งหมดดังกล่าวพบว่า เอนไซม์เบต้า-กลูโคซิเดส มีความ บริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 169 เท่า และปริมาณแอคทิวิตี้ที่หลงเหลือเท่ากับ 12 เปอร์เซนต์ เมื่อศึกษาขนาดของโมเลกุล ของเอนไซม์บนคอลัมน์เซฟาคริล เอส-300 ได้ค่า 87 กิโลดาลตัน และบนอิเลคโตรโฟรีซีส(SDS-PAGE) ได้ค่า 80 กิโลดาลตัน และพบว่าเอนไซม์มีค่า pI เท่ากับ 9.3 จากการศึกษาคุณสมบัติของเอนไซม์เบต้า-กลูโคซิ เดส ที่ทำให้บริสุทธิ์แล้วพบว่าเอนไซม์มีความจำเพาะต่อพันธะเบต้า-กลูโคซิดิกสูงมาก โดยจะไม่ย่อยพันธะไกล โคซิดิกชนิดอื่นๆ และยังพบว่าเอนไซม์แสดงความจำเพาะต่อกลูโคสที่ตำแหน่ง C-26 ของสับสเตรทธรรมชาติ (torvoside A และ torvoside H) นอกจากนี้เบต้า-กลูโคซิเดส สามารถย่อย Dalcochinin-8′-β- glucoside ซึ่งเป็นสับสเตรทธรรมชาติของเบต้า-กลูโคซิเดสจากต้นพะยูง และเอนไซม์สามารถย่อยอัลคิลกลูโค ไซด์โดยอัตราเร่งของปฏิกิริยาเพิ่มขึ้นเมื่อความยาวของโซ่คาร์บอนเพิ่มขึ้นแต่ไม่สามารถย่อยสับสเตรทธรรมชาติ ของเบต้า-กลูโคซิเดสชนิดอื่นๆได้ จากการศึกษาทางด้านจลศาสตร์ของเอนไซม์เบต้า-กลูโคซิเดสบริสุทธิ์ต่อ สับสเตรทธรรมชาติ torvoside A และ torvoside H ได้ค่า Km เท่ากับ 63 และ 68 ไมโครโมลาร์ตาม ลำดับ ซึ่งต่ำกว่าสับสเตรทสังเคราะห์ pNP-β-glucoside และ 4-MU-β-glucoside ซึ่งมีค่า Km เท่ากับ 1.03 และ 0.78 มิลลิโมลาร์ตามลำดับ เมื่อศึกษาลำดับของกรดอะมิโนภายในสายโพลีเปปไทด์พบว่าเอนไซม์เบ ต้า-กลูโคซิเดส มีความเหมือนกับเบต้า-กลูโคซิเดส ตระกูลที่ 3

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Jisnuson Svasti

Role: Thesis Advisors

Created: 2003

Modified: 2553-02-08

Issued: 2009-12-24

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740437311

CallNumber: TH|bD896p 2003

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Biochemistry

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4136261.pdf	2.18 MB	127	2024-08-09 19:50:28

ใช้เวลา

0.226775 วินาที