Investigation of molecular stabilization in the conserved regions of the Bacillus thuringiensis Cry4B toxin

การศึกษาเสถียรภาพในระดับโมเลกุลที่บริเวณอนุรักษ์ของโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุงชนิด Cry4B

Name: Anchanee Sangcharoen

LCSH: Bacillus thuringiensis

LCSH: Protein folding

LCSH: Toxins

Abstract: Among the Bacillus thuringiensis Cry toxins, there are five highly conserved blocks of amino acid sequence in three functional domains, which are believed to play an important role for structural folding and stabilization. To investigate a contribution of the conserved residues in these blocks of the Cry4B toxin, the mutants, R251A, D259N, Y267F, T285V, H466Y, D470N, K487A, R627A and E629Q, were constructed using the mutant toxin which has no internal cleavage in the α5-α6 loop, R203Q, as a template. The generated mutant toxins were expressed as a 130-kDa protoxin under IPTG induction. Most of the mutants were expressed in a comparable level to the template. The mutant toxins, R251A, H466Y and D470N were soluble in carbonate buffer pH 9.8 and produced the 65-kDa active form under trypsin processing. The stabilizing free energy values of R203Q template, R251A, H466Y and D470N obtained from a chemical unfolding experiment under GuHCl titration are 23.72, 24.98, 23.39 and 23.38 kcal/mole, respectively. The results implied that these mutants still adopted the native-like structure. The other mutants, D259N, Y267F, T285V, K487A, and R627A, were obtained as insoluble products in the native buffer. For E629Q, it was found as soluble protoxin but gave no product of a 65-kDa protein. These results suggested that the stabilizing interactions provided by these residues have critical contributions in protein folding and molecular stabilization. These stabilizing interactions were identified by using the Cry4B X-ray structure as an electrostatic interaction and hydrogen bonding that occur among the residues of conserved blocks"

Abstract: จากการเปรียบเทียบลำดับของกรดอะมิโนในโปรตีนสารพิษ (Cry) ชนิดต่างๆ จากแบคทีเรีย Bacillus thuringiensis พบว่า มีบริเวณอนุรักษ์อยู่ 5 บริเวณกระจายตัวอยู่ในโครงสร้างโปรตีนทั้ง 3 โดเมน ในการศึกษาเบื้องต้นโดยใช้โปรตีนฆ่าลูกน้ำยุงชนิด Cry4B เป็นตัวอย่าง พบว่ากรดอะมิโนอนุรักษ์ที่ตั้งอยู่ในบริเวณเหล่านี้ มีบทบาทและความสำคัญอย่างยิ่งต่อเสถียรภาพและการ ม้วนพับตัวของโครงสร้างโปรตีน ในงานวิจัยนี้ จึงได้มีการสร้างโปรตีนกลายพันธุ์ของลำดับอะมิโนชนิด R251A D259N Y267F T285V H466Y D470N K487A R627A และ E629Q ขึ้น โดยใช้ R203Q ซึ่งเป็นโปรตีนสารพิษกลายพันธุ์ที่ไม่ถูกตัดระหว่างเกลียวอัลฟาที่ 5 และ 6 เป็นโครงสร้างต้นแบบ จากการทดลองพบว่า โปรตีนกลายพันธุ์เกือบทุกชนิดมีระดับการแสดงออกของโปรตีนภายใต้การเหนี่ยวนำของสารละลาย IPTG มีปริมาณเทียบเท่ากับโปรตีนต้นแบบ โดยโปรตีนกลายพันธุ์ R251A H466Y และ D470N มีคุณสมบัติต่างๆ เช่น ความสามารถในการละลายในสารละลายคาร์บอเนต การตัดย่อยด้วยเอนไซม์จนได้โครงสร้างที่ออกฤทธิ์ได้ และเสถียรภาพต่อสารละลาย GuHCl คล้ายกับโปรตีนต้นแบบ ซึ่งสามารถบ่งชี้ได้ว่า โปรตีนกลายพันธุ์เหล่านี้มีความสามารถในการม้วนพับตัวเป็นโครงสร้างคล้ายกับโปรตีนต้นแบบ ในขณะที่ โปรตีนกลายพันธุ์ D259N Y267F T285V K487A และ R627A สูญเสียคุณสมบัติในการละลายเมื่อเทียบกับโปรตีนต้นแบบ สำหรับโปรตีนกลายพันธุ์ E629Q มีความสามารถในการละลายแต่ไม่พบโปรตีนขนาด 65 กิโลดาลตันหลังจากการถูกตัดย่อยด้วยเอนไซม์ จากผลการทดลองข้างต้น สามารถระบุได้ว่า ปฏิสัมพันธ์ที่เกิดขึ้นบนกรดอะมิโนที่ถูกเปลี่ยนแปลงเหล่านี้มีความสำคัญต่อการม้วนพับตัวของโครงสร้างและการรักษาเสถียรภาพของโปรตีน การเปลี่ยนแปลงกรดอะมิโนเหล่านี้ทำให้โปรตีนไม่สามารถเกิดการม้วนพับเป็นโครงสร้างที่ถูกต้องได้ ในการพิจารณาโดยใช้โครงสร้าง 3 มิติของโปรตีน Cry4B พบว่าปฏิสัมพันธ์เหล่านี้เกิดขึ้นจากปฏิกิริยาระหว่างประจุ หรือพันธะไฮโดรเจน ซึ่งเกิดขึ้นระหว่างกรดอะมิโนที่มีตำแหน่งตั้งอยู่ในบริเวณอนุรักษ์ต่างๆ ทั้งสิ้น"

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Chartchai Krittanai

Role: Thesis Advisors

Created: 2003

Modified: 2020-11-03

Issued: 2009-12-08

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740435297

CallNumber: TH A539i 2003

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Molecular Genetics and Genetic Engineering

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4436441.pdf	9.23 MB	17	2018-05-29 01:54:43

ใช้เวลา

0.380552 วินาที