PRSV gene vector for transient expression of foreign proteins in plants

การใช้ไวรัสใบด่างจุดวงแหวนในมะละกอเป็นยีนพาหะเพื่อผลิตโปรตีนแปลกปลอมในพืชแบบชั่วคราว

Name: Janjira Thaipadungpanit

LCSH: Genetic vectors

LCSH: Protoplasts

LCSH: Transformations (Mathematics)

Abstract: Papaya ringspot virus (PRSV) causes a serious disease of papaya and some cucurbits. Potyvirus particle is non-enveloped so its genome can be enlarged by gene insertion with no size limit. Furthermore, the genome encodes a polyprotein, which is modified after translation step to generate functional proteins. The foreign protein introduced in the viral genome, therefore, is produced in an equimolar ratio as viral proteins. Thus, PRSV can be considered as a transient expression vector for effective foreign protein production in plants. In this study, the cDNA clone of PRSV type P (PRSV-P) Thai isolate was used as a virus-based vector. The full-length cDNA clone of PRSV-P was constructed by assembling three overlapping cDNA fragments. This full length clone was under the control of partially duplicated CaMV 35s promoter, poly (A) tract and NOS terminator. The intermediate vector containing the P1 and HC-Pro genes of PRSV-P was modified by adding the SacII endonuclease recognition site and the cleavage site for NIa proteinase between the P1 and HC-Pro genes. The green fluorescent protein gene (mgfp4) containing SacII endonuclease recognition sites was inserted between the P1 and HC-Pro genes. The cDNA fragment containing the P1 gene, the GFP gene, the NIa proteinase clevage site and the Hc-Pro gene was cut from this intermediate clone by PacI/StuI digestion and exchanged to the full length cDNA clone. The protocol of papaya protoplast mesophyll isolation was established to obtain the best quality and quantity of the protoplasts for DNA transformation. The concentration of Clorox use for leaf surface sterilization, type and concentration of cellulase, digestion time, leaf selection and centrifugation force in protoplast isolation steps were optimized. The average yield of protoplast was 2.33×106 cells g-1. Polyethyleneglycol (PEG) was chosen to mediate the transformation of the mgfp4 plasmid into papaya, tobacco, and zucchini mesophyll protoplasts. The PEG mediated technique showed higher protoplast transformation efficiency than the electroporation technique. The transformation in tobacco and zucchini protoplasts showed higher efficiency than papaya protoplast transformation. GFP expression was detected in protoplasts transformed with mgfp4 plasmid but not in protoplasts transformed with the PRSV vector. The RT-PCR analysis was used to detect the mRNA of mgfp4 gene in the transformed protoplasts, however, it was not possible to clarify whether mRNA of mgfp4 gene existed in the transformed protoplasts. The northern blot analysis, alternatively performed for the same purpose, was, on the other hand, not sensitive enough to detect the mgfp4 mRNA. The PRSV CP mRNA was detected in papaya leaf bombarded with the PRSV vector by RT-PCR analysis at 3 days post transformation. However, none of the zucchini plants bombarded with the full-length cDNA of PRSV genome or the PRSV vector showed infection symptoms during 60 days post bombardment."

Abstract: ไวรัสใบด่างจุดวงแหวนในมะละกอ (Papaya ringspot virus, PRSV) เป็นสาเหตุสำคัญของโรคระบาดซึ่งพบในมะละกอและแตงบางชนิด ไวรัสชนิดนี้อยู่ในกลุ่ม potyviridae ซึ่งมีรูปร่างแบบ non-enveloped ดังนั้นจึงสามารถสอดแทรกยีนจากสิ่งมีชีวิตอื่นเข้าไปในจีโนมของไวรัสโดยไม่มีข้อกำจัดของขนาดจีโนม นอกจากนั้นจีโนมของไวรัสนี้มีการแปลรหัสเป็นโพลีโปรตีนเพียงเส้นเดียว ซึ่งจะถูกตัดให้เป็นโปรตีนย่อยที่มีหน้าที่เฉพาะชนิดต่างๆ จึงทำให้สามารถผลิตโปรตีนจากยีนอื่นที่แทรกเข้าไปในจีโนมของไวรัสนี้ในอัตราที่เท่ากันกับการผลิตโปรตีนอื่นๆของไวรัส ด้วยคุณสมบัติดังกล่าวทำให้ PRSV น่าจะเป็นยีนพาหะที่ใช้ผลิตโปรตีนแปลกปลอมในพืชได้อย่างมีประสิทธิภาพ งานวิจัยนี้ได้สร้างไวรัสพาหะที่มี cDNA ทั้งเส้นของจีโนมไวรัส PRSV ชนิด P (PRSV-P) โดยได้จากการประกอบกันของ cDNA 3 ชิ้นที่เหลื่อมกันที่ได้จากโคลนของ PRSV-P cDNA ทั้งเส้นนี้ถูกควบคุมโดยโปรโมเตอร์ CaMV 35S แบบ partially duplicated, ปลาย poly(A) และ NOS terminator การสอดแทรกยีนของโปรตีนสีเขียวเรืองแสง (mgfp4) ซึ่งเป็นยีนเครื่องหมาย เข้าไปในจีโนมไวรัสเพื่อใช้ในการศึกษานี้ ทำโดยการใช้โคลนของ cDNA ที่มีส่วนของยีน P1 และ ยีน HC-Pro เป็นตัวเริ่มต้นโดยใส่ชิ้นดีเอนเอที่มีส่วนที่สามารถตัดโดยเอนไซม์ SacII และที่มีส่วนที่สร้างโปรตีนที่สามารถตัดออกได้โดยใช้โปรตีน Nia เข้าไประหว่างยีน P1 และยีน HC-Pro แล้วใส่ยีน mgfp4 ซึ่งมีส่วนที่ตัดได้ด้วยเอนไซม์ SacII เข้าไปที่ตำแหน่ง SacII ระหว่างยีน P1 และยีน HC-Pro จากนั้นทำการตัดชิ้นดีเอ็นเอที่มียีน P1 ยีน mgfp4 ยีนที่สร้างโปรตีนที่สามารถตัดออกได้โดยใช้โปรตีน Nia และยีน HC-Pro โดยใช้เอนไซม์ PacI / StuI แล้วสับเปลี่ยนชิ้นดีเอ็นเอนี้เข้าไปใน cDNA ทั้งเส้นของจีโนมไวรัสที่ตำแหน่งเดียวกัน ได้ทำการสกัดโปรโตพลาสจากเซลล์ mesophyll ของใบมะละกอ โดยทดสอบหาขั้นตอนและสภาวะที่เหมาะสม เพื่อให้ได้โปรโตพลาสที่มีคุณภาพและปริมาณที่ดีที่สุดสำหรับ DNA transformation ได้แก่ ขั้นตอนการใช้คลอร็อกเพื่อฆ่า เชื้อบนผิวใบ, ชนิดและความเข้มข้นของเอนไซม์ Cellulase, เวลาที่ใช้ในการย่อยใบ, การเลือกใบ และแรงที่ใช้ในการปั่นเหวี่ยงเซล พบว่าปริมาณเฉลี่ยของโปรโตพลาสที่ได้จากการสกัดคือ 2.33×106 เซลล์ต่อกรัมของใบมะละกอ ได้ใช้โพลีเอธิลีนไกลคอล (PEG) ในการนำยีนพาหะ mgfp4 เข้าสู่โปรโตพลาสเซลล์ของใบมะละกอ, ใบยาสูบ, และใบแตงซูกินิ พบว่าการนำยีนเข้าสู่โปรโตพลาสของใบยาสูบและใบแตงซูกินิมีประสิทธิภาพสูงกว่าการนำยีนเข้าสู่โปรโตพลาสของใบมะละกอ และพบว่าเทคนิคการใช้ PEG เพื่อการนำยีนเข้าสู่โปรโตพลาสมีประสิทธิภาพเหนือกว่าการใช้เทคนิค electroporation จากการทดลองสามารถตรวจพบการแสดงออกของยีน GFP ในโปรโตพลาสที่ได้รับยีนพาหะ mgfp4 แต่ไม่พบการแสดงออกของโปรตีนนี้ในโปรโตพลาสที่ได้รับไวรัสพาหะ ได้ทดลองใช้เทคนิค RT-PCR เพื่อค้นหา mRNA ของยีน mgfp4 ที่อยู่ในโปรโตพลาสที่ได้รับการถ่ายยีนแล้ว แต่การวิเคราะห์นี้ไม่สามารถยืนยันได้ว่ามีการสร้าง mRNA จากยีน mgfp4 ในโปรโตพลาสที่ได้รับการถ่ายยีน เนื่องจากไม่สามารถกำจัดดีเอ็นเอของยีน mgfp4 ออกจากอาร์เอนเอที่สกัดจากโปรโตพลาสที่ได้รับการถ่ายยีน ในการทดลองใช้เทคนิค Northern blot ทำการตรวจหา mRNA ของยีน mgfp4 ไม่สามารถตรวจพบ mRNA ดังกล่าวในโปรโตพลาส ซึ่งเกิดจากปริมาณ mRNA ที่มีน้อยมากและเทคนิคนี้มีความไวไม่เพียงพอ ในการทดลองนำไวรัสพาหะเข้าสู่ใบมะละกอด้วยวิธียิงอนุภาค สามารถใช้เทคนิค RT-PCR ตรวจพบ mRNA ของยีนโปรตีนเปลือกไวรัส (PRSV-CP) หลังจากที่ถูกยิงด้วยไวรัสพาหะแล้วสามวัน แต่เมื่อใช้ต้นแตงซูกินีในการทดลองเพื่อดูอาการไม่พบการติดโรคในระหว่าง 60 วันหลังจากที่นำพลาสมิดที่มีจีโนมของไวรัสทั้งเส้นหรือไวรัสพาหะเข้าสู่แตงโดยวิธียิงอนุภาค"

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Juricek, Miloslav

Role: Thesis Advisors

Created: 2003

Modified: 2020-04-19

Issued: 2009-11-30

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740434118

CallNumber: TH J33p 2003

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Molecular Genetics and Genetic Engineering

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4237011.pdf	2.59 MB	40	2023-06-26 10:09:52

ใช้เวลา

0.421931 วินาที