Physiology of Bacillus thuringiensis subspecies Kurstaki HD-73 cultivated in yeast extract-containing media

สรีรวิทยาของจุลินทรีย์ Bacillus thuringiensis subspecies Kurstaki HD-73 ที่เจริญในอาหารที่มีสารสกัดจากยีสต์

Name: Catherin Assantachai

LCSH: Bacillus thuringiensis

LCSH: Physiology

LCSH: Yeast

Abstract: ได้มีการศึกษาการเจริญ การสร้างสปอร์และผลึกโปรตีนของจุลินทรีย์ Bacillusthuringiensis supsp. Kurstaki HD-73 โดยการเลี้ยงในขวดเขย่าและถังหมักซึ่งใช้อาหารที่มีสารสกัดจากยีสต์ร่วมกับกลูโคสที่ความเข้มข้นต่าง ๆ โดยได้ศึกษาผลกระทบของการเติมกลูโคสและกรดอะซิติก, การกำจัดปริมาณออกซิเจน, การไม่ใส่แอมโมเนียมซัลเฟต, การเพิ่มกรดอะมิโนซิสเตอีน และสาร EDTA ต่อการสร้างสปอร์และผลึกโปรตีน นอกจากนี้ได้มีการตรวจสอบความเสถียรของผลึกโปรตีนในอาหารที่มีค่า pH ต่างกัน ทั้งที่มีและไม่มีสารยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ protease จากผลการศึกษาพบว่า ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี 2% กลูโคสและ 1% สารสกัดจากยีสต์ การสร้างสปอร์ และผลึกโปรตีนมีความเข้มข้นสูงที่สุด (2.63±0.63x10(9) สปอร์/มล., 1.2 มก.โปรตีน/มล.) ที่อัตราส่วนของกลูโคสต่อสารสกัดจากยีสต์น้อยกว่า 2 การเติมกรดอะซิติกเพื่อเป็นแหล่งพลังงานในช่วงหลังจากจุลินทรีย์โตช้าลงช่วยเพิ่มความเข้มข้นของผลึกโปรตีน อย่างไรก็ตามการมีกรดอะซิติกไม่ช่วยเพิ่มการเจริญของเซลล์และการสร้างสปอร์ นอกจากนี้กรดอะซิติกที่มากเกินไปมีผลทำให้จำนวนเซลล์และสปอร์ลดลงด้วยการเติมกลูโคสในช่วงหลังจากจุลินทรีย์โตช้าลงทำให้เซลล์บางส่วนซึ่งอยู่ในระยะต้นของการสร้างสปอร์มีการเจริญขึ้นอีกและสร้างเฉพาะผลึกโปรตีนเป็นส่วนใหญ่ ปริมาณโปรตีนสุดท้ายในอาหารเลี้ยงเชื้อเพิ่มขึ้น 2-3 เท่า ตามจำนวนเซลล์ที่เพิ่มขึ้น (สูงถึง 2 มก. โปรตีน/มล.) แต่มีความเป็นพิษต่อหนอนแมลงต่ำกว่ากรณีควบคุมและกรณีเติมกรดอะซิติก ความสำคัญของแหล่งคาร์บอนและพลังงานที่สะสมในเซลล์ เช่น กรดไขมัน ต่อการสร้างผลึกควรมีการศึกษาต่อไปการจำกัดปริมาณออกซิเจนไม่ลดปริมาณโปรตีนพิษแม้ว่าการเจริญของเซลล์และการสร้างสปอร์น้อยลง การไม่ใส่แอมโมเนียมซัลเฟตลงในอาหารที่มี 2% กลูโคสและ 1% สารสกัดจากยีสต์ไม่มีผลกระทบต่อการเจริญของเซลล์แต่มีผลเสียต่อการสร้างสปอร์และผลึกโปรตีนโดยสปอร์ลดลง 40% และผลึกโปรตีนลดลง 20% การเติมกรดอะมิโนซิสเตอีน (0.04% w/v) ในระยะต้นของการสร้างสปอร์ทำให้สปอร์ลดลง 10 เท่า (0.33x10(9) สปอร์/มล.) แต่ผลึกโปรตีนลดลงเพียง 2 เท่า(0.66 มก./มล.) การเติม EDTA (2 mM) ในอาหารเลี้ยงเชื้อตั้งแต่เริ่มต้นแม้ทำให้เซลล์เจริญได้เกือบเท่าระดับปกติแต่พบการสร้างสปอร์และผลึกโปรตีนมีอยู่ในระดับต่ำ ขณะที่การเติม EDTA ภายหลังจากเซลล์เข้าสู่ระยะการสร้างสปอร์แล้วแทบไม่มีผลต่อการสร้างสปอร์และผลึกโปรตีน นอกจากนี้ยังพบว่าความเสถียรของผลึกโปรตีนได้รับอิทธิพลหลักจาก alkalineserine proteases ที่ค่า pH ≥ 8

Abstract: The growth, sporulation and crystal formation of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-73 in shake flask and fermenter cultures with yeast extract media (YE) and various amounts of glucose were followed. Effects of glucose addition and/or acetic acid addition, oxygen limitation, omission of ammonium sulfate, and supplementation of cysteine and EDTA on spore and crystal formation were investigated. In addition, stability of crystals in a yeast extract medium at different pH-values with and without protease inhibitors was studied. A glucose:yeast extract ratio of 2 was optimal for growth, sporulation and crystal formation. In 2% glucose, 1% yeast extract medium, spore count was 2.63±0.63x109 spores/ml and crystal protein was 1.2 mg/ml. At glucose:yeast extract ratio less than 2, addition of acetic acid as an energy source after cessation of vegetative growth increased crystal protein. However, cell growth and sporulation was not improved by the presence of acetic acid and too much acetic acid led to a decrease in the amount of cells and spores. Addition of glucose after cessation of growth in yeast extract-containing media caused re-growth of some early stage sporeforming cells and then crystals mainly formed. The crystal protein was increased 2-3 times (up to ca. 2 mg/ml) but toxicity toward insect larvae was low as compared with the control and the case of acetic acid addition. The importance of endogenous storage carbon and energy sources e.g. fatty acids for spore and crystal formation should be further investigated. Oxygen limitation decreased amount of vegetative cells and spores but crystal protein was not decreased. Omission of ammonium sulfate in 2% glucose, 1% yeast extract medium did not affect vegetative cell growth but it had a negative effect on sporulation (40% reduction of spore count) and crystal formation (20% reduction of crystal protein). Presence of cysteine (0.04% w/v) at early sporulation gave ca. 10-times lower spore count but only 2-times lower crystal protein. EDTA (2 mM) in 1% YE, 2% glucose medium could provide almost normal cell-growth with very low production of free spores and crystals while the addition of EDTA after sporulation started (at 10 h) hardly affected spore and crystal formation. Finally, stability of free crystals was mainly influenced by activity of alkaline serine proteases at pH ≥ 8.

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Verduyn, Cornel

Role: Thesis Advisors

Created: 2003

Modified: 2020-04-19

Issued: 2009-11-30

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740432611

CallNumber: TH C363p 2003

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Biotechnology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4236956.pdf	1.71 MB	40	2018-05-29 01:41:58

ใช้เวลา

0.268704 วินาที