Optimization of PCR-multiplex SSCP to identify mutations and polymorphisms at the LDL receptor locus

การหาสภาวะที่เหมาะสมที่สุดของเทคนิค PCR-multiplex SSCP เพื่อค้นหาการกลายพันธุ์และความหลากหลายในยีน LDL receptor

Name: Patthamawadee Charoensuk

MeSH: Receptors, LDL

MeSH: Hypercholesterolemia, Familial

MeSH: Polymerase Chain Reaction

MeSH: Polymorphism, Single-Stranded Conformational

Abstract: Familial Hypercholesterolemia is caused by a mutation within the low density lipoprotein receptor (LDLR) gene. The mutation impairs proper function of LDLR and results in very high level of plasma cholesterol. Such levels result in early and severe atherosclerosis and hence substantial excess mortality from coronary heart disease. Diagnosing FH on clinical grounds is relatively difficult, and previous genetic methods are too cumbersome for routine use. Thus, there is a need to develop screening strategies to ensure that more patients are being correctly diagnosed and treated. In this study, restriction enzymes were used to digest hypermutable CG region of some PCR-amplified exons to increase the sensitivity of multiplex SSCP. These RE digested-PCR products were selectively combined and analyzed by multiplex SSCP. Moreover, the multiplex SSCP was analyzed in gradient polyacrylamide gel to increase the resolution. The conditions of these multiplex-SSCP analyses were optimized until individual exon of each multiplex set was separately apparent. Six combination sets of PCR-multiplex SSCP were set up and five of them were validated by known mutations (M412T, S554L and IVS3+1G>T) and known polymorphisms (G1414A). No validation in combination set 3 was made because no mutation or polymorphism was available in this combination set. The common AvaII (exon13 in combination set 4), HincII (exon12 in combination set 5) and a novel polymorphism in exon 8 (in combination set 5) were readily detected in these samples using the PCR-multiplex SSCP protocols developed in this study. These optimized PCRmultiplex SSCP protocols are expected to be useful for screening mutations and polymorphisms in the whole coding region (plus promoter) of LDL receptor gene. It was rapid, simple, sensitive and was expected to be a potential tool for mutation screening of large numbers of clinical samples.

Abstract: Familial hypercholesterolemia (FH) เป็นโรคทางพันธุกรรมที่เกิดจากการกลายพันธุ์ ในยีน low density lipoprotein receptor (LDLR) ส่งผลให้การทำหน้าที่ของ LDLR ผิดปกติ ไป ทำให้เกิดการเพิ่มขึ้นของระดับโคเลสตอลรอลในกระแสเลือด ระดับโคเลสตอลรอลที่เพิ่มขึ้นนี้ จะทำให้เกิดกระบวนการตีบตันของหลอดเลือด (Atherosclerosis) และเสียชีวิตเพราะโรคหลอด เลือดหัวใจอุดตันในที่สุด การตรวจพบความผิดปกติของยีน LDLR ตั้งแต่เริ่มแรก (early diagnosis) จะทำให้สามารถป้องกันการเกิดโรคหลอดเลือดหัวใจได้ ปัจจุบันการวินิจฉัยโรคโดย อาศัยข้อมูลทางคลินิกเพียงอย่างเดียวนั้นยังไม่เพียงพอ จึงได้มีการวินิจฉัยยืนยัน FH ด้วยเทคนิคทาง Molecular Biology อีกด้วย อย่างไรก็ตามเทคนิคเหล่านี้ค่อนข้างยุ่งยากและใช้เวลามากสำหรับยีน LDLR ซึ่งเป็นยีนที่ค่อนข้างใหญ่ การศึกษาในครั้งนี้จึงได้พัฒนาเทคนิค PCR-multiplex SSCP ขึ้น โดยใช้เอ็นไซม์ตัดจำเพาะ ตัดตรงบริเวณที่เป็น CG (ซึ่งเกิดการกลายพันธุ์ได้ง่าย) ของชิ้นส่วนดี เอ็นเอ และ ทำ gradient polyacrylamide gel electrophoresis เพื่อเพิ่มความไวให้กับเทคนิค SSCP อีกด้วย จนกระทั้งได้สภาวะที่เหมาะสมและแยกแยะความแตกต่างได้อย่างชัดเจน จาก การศึกษา สามารถจัดจำแนก PCR-multiplex SSCP ได้ 6 กลุ่ม สำหรับการวิเคราะห์ promoter และ exons ทั้งหมดของยีน LDLR และพิสูจน์ว่าวิธีนี้ใช้ได้จริงด้วยการนำตัวอย่างของผู้ป่วยที่ ทราบว่ามีความผิดปกติทางพันธุกรรมหรือมีการเปลี่ยนแปลงของลำดับเบสมาทดสอบ นอกจากนี้ยัง ใช้ screen ผู้ป่วยจำนวน 13 คน และสามารถตรวจพบการเปลี่ยนแปลงของความหลากหลายทาง พันธุกรรมชนิด AvaII และ HincII และยังค้นพบการเปลี่ยนแปลงความหลากหลายทางพันธุกรรม ชนิดใหม่ใน exon 8 อีกด้วย คาดว่าวิธี PCR-multiplex SSCP นี้จะเป็นประโยชน์ในการตรวจ กรองความผิดปกติของยีนหรือการเปลี่ยนแปลงลำดับเบสทั้งหมดของยีน LDLR ซึ่งคิดว่าจะเป็นวิธี ที่รวดเร็ว ง่ายและมีความไวสูงเหมาะสำหรับใช้ตรวจกรองตัวอย่างที่มีปริมาณมากๆได้

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Klai-upsorn Pongrapeeporn

Role: Thesis Advisors

Created: 2005

Modified: 2553-06-17

Issued: 2009-07-30

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740466613

TH P315o 2005

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Biochemistry

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4536230.pdf	8.41 MB	40	2026-05-26 18:16:01

ใช้เวลา

0.28243 วินาที