Expression of the rat organic anion transporter 1 (rOAT1) in the yeast saccharomyces cerevisiae

การแสดงออกของโปรตีน organic anion transporter 1 ของหนูในยีสต์ Saccharomyces cerevisiae

Name: Suphansa Sawamiphak

MeSH: Membrane Proteins

MeSH: Organic Anion Transporters

MeSH: Saccharomyces cerevisiae

LCSH: Rats

Abstract: Organic anion transporter 1, OAT1, localized in the basolateral membrane of the kidney proximal tubule, is an essential part of the renal organic anion excretion system. A wide variety of endogenous substances, xenobiotics and their metabolites have been shown to be translocated into the proximal tubular cells in exchange for an intracellular dicarboxylate by OAT1. In the present study the yeast Saccharomyces cerevisiae was employed as a heterologous expression system of the rat organic anion transporter 1 (rOAT1) and its functional characteristic underwent preliminary examination. There is a scarce expression of mammalian membrane protein in yeast, most likely caused by an intrinsic determinant within the gene and improper post-translational modification, most importantly in glycosylation. The N-terminus of rOAT1, consisting of many minor codons rarely used in yeast, was modified by fusion of the readily translatable hemagglutinin (HA) epitope sequence preceding the start codon of rOAT1. In addition, to find out the suitable expression system for rOAT1, different yeast expression plasmids were chosen. This included inducible, integrative and multicopy plasmid. Furthermore, the constitutive ADH1p and inducible GAL1p were used for controlling gene expression. Since protein folding and stability often favor low temperature, glycosylation at different temperature, 16°C and 30°C was also studied. Western blotting with polyclonal OAT1 antibody and monoclonal HA antibody showed that many proteins of the molecular mass, from 60 kDa to 77 kDa, corresponding to the non-glycosylated and the glycosylated rOAT1 gene product, respectively, were detectable in the total membrane extract of recombinant yeast harboring the HArOAT1, but not in the cells harboring the wild type rOAT1 gene. The GAL1-inducible expression in multicopy plasmid was found to be the highest level while the ADH1-constitutive expression in integrative plasmid was the least. Upon endoglycosidase H digestion, the sizes were reduced mostly to 60 kDa, suggesting that a large portion of rOAT1 was expressed in yeast as the glycosylated protein. No difference was found in the expression and glycosylation of rOAT1 expressed at different growth temperature. The transport function of rOAT1 was characterized by measurement of the radiolabeled substrate [14C]PAH which was taken up into yeast cells. The PAH uptake ability of the yeast-expressed rOAT1, which correlated with the protein expression level by different plasmids, was observed. Collectively, these studies suggest that rOAT1 is functionally expressed in the recombinant S. cerevisiae and the codon chosen at the N-terminus is an important factor that affects the expression.

Abstract: Organic anion transporter1 (OAT1) ซึ่งพบในท่อไตส่วนต้นเป็นโปรตีนที่มีบทบาทสำคัญในการทำหน้าที่ ขับสารอินทรีย์ประจุลบของไต สารอินทรีย์หลายชนิดที่เป็นพิษต่อร่างกายทั้งที่อยู่ภายในและที่ได้รับจากภายนอก จะถูกขับออก โดย OAT1 ซึ่งเกิดขึ้นโดยแลกเปลี่ยนกับสารกลุ่มไดคาร์บอกซีเลต งานวิจัยนี้ศึกษาการแสดงออกของยีน OAT1 ของหนู (rOAT1) ในยีสต์สายพันธุ์ Saccharomyces cerevisiae และศึกษาการทำงานของโปรตีนนี้ในการขนส่งสารอินทรีย์ ประจุลบ จากข้อเท็จจริงที่ว่าข้อจำกัดที่สำคัญต่อการแสดงออกของโปรตีนที่เยื่อหุ้มเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมในยีสต์นั้น ส่วนใหญ่อาจเกิดจากปัจจัยภายในยีนและความไม่เหมาะสมในการดัดแปลงโปรตีนหลังจากการแปลรหัส โดยเฉพาะอย่างยิ่งการ เติมโมเลกุลคาร์โบไฮเดรต N-terminus ของ rOAT1 ที่ประกอบด้วยรหัสของกรดอะมิโนที่พบน้อยครั้งในยีสต์ จึงถูก เปลี่ยนแปลงโดยการนำ Hemaglutinin (HA) ซึ่งประกอบด้วยรหัสของกรดอะมิโนที่พร้อมจะถูกลอกรหัสมาเชื่อมเข้ากับ ก่อนหน้าจุดเริ่มต้นการลอกรหัสของ rOAT1 นอกจากนี้ยังได้ทำการศึกษาระดับของการแสดงออกของ rOAT1 โดยใช้ expression plasmid ชนิด integrative และ multicopy รวมทั้งใช้ promoter ชนิด constitutive (ADH1p) และ inducible (GAL1p) ควบคุมการแสดงออกของยีน และเนื่องจากการจัดรูปร่างและเสถียรภาพของโปรตีนมักเกิดขึ้นได้ ดีในอุณหภูมิต่ำ การศึกษานี้จึงได้ทำการเปรียบเทียบการเกิด glycosylation ของ rOAT1 ที่อุณหภูมิ 16°C และ 30°C เมื่อทำ Western blot ของสารสกัดเยื่อหุ้มเซลล์โดยใช้แอนติบอดีจำเพาะต่อ OAT1 และ HA พบว่าสามารถตรวจพบ โปรตีนที่มีขนาดใกล้เคียงกันตั้งแต่ 60 ถึง 77 kDa ซึ่งสอดคล้องกับขนาดของ rOAT1 ที่ไม่มีและมีการเติมโมเลกุลของ คาร์โบไฮเดรตตามลำดับ แต่ไม่พบโปรตีนเหล่านี้ในยีสต์ที่มียีน wild type rOAT1 นอกจากนี้ยังพบว่าระดับการแสดงออก ของโปรตีนโดย GAL1p โดย multicopy plasmid มีระดับสูงสุด ในขณะที่การแสดงออกโดย ADH1p โดย integrative plasmid มีระดับต่ำสุด เมื่อย่อยโปรตีนด้วย endoglycosidase H พบว่าขนาดของโปรตีนส่วนใหญ่ลดลง เหลือ 60 kDa แสดงให้เห็นว่า มีการแสดงออกของ rOAT1ในยีสต์ และส่วนหนึ่งของโปรตีนนั้นถูก glycosylated และ ไม่พบความแตกต่างในการแสดงออกและ glycosylation ของโปรตีนในยีสต์ซึ่งเจริญเติบโตที่อุณหภูมิต่างกัน สำหรับ การศึกษาการทำหน้าที่ของโปรตีนในการขนส่งสารอินทรีย์ประจุลบนั้น ทำโดยการวัดปริมาณของ substrate ที่ติดฉลากรังสี คือ [14C]PAH ที่ถูกนำเข้าไปในเซลล์ยีสต์ พบว่ายีสต์ที่มีการแสดงออกของโปรตีน rOAT1 มีความสามารถในการขนส่ง PAH ได้ นอกจากนี้ปริมาณการขนส่ง PAH สอดคล้องกับระดับการแสดงออกของโปรตีนด้วยพลาสมิด ชนิดต่างๆ โดยสรุปแล้ว การศึกษานี้แสดงให้เห็นว่ามีการแสดงออก rOAT1 ในยีสต์โดยโปรตีนนั้นสามารถทำหน้าที่ได้ และการ เลือกรหัสของกรดอะมิโนที่ N-terminus ของ rOAT1 เป็นปัจจัยสำคัญที่ส่งผลกระทบต่อการแสดงออกของโปรตีน

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Chuenchit Boonchird

Role: Thesis Advisors

Created: 2009-07-24

Modified: 2553-06-11

Issued: 2009-07-24

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740449921

CallNumber: TH S959ex 2004

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Biotechnology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4536532.pdf	2.44 MB	7	2018-05-29 01:16:12

ใช้เวลา

0.253845 วินาที