Purification and characterization of chitinase from escherichia coli harboring recombinant plasmid containing chitinase encoding gene from bacillus circulans No.4.1

การทำให้เอนไซม์ไคติเนสบริสุทธิ์และการศึกษาคุณสมบัติของเอนไซม์จากเชื้อ escherichia coli ที่มีพลาสมิดลูกผสมของยีนไคติเนสจากเชื้อ Bacillus circulans No.4.1

Name: Patcharaporn Siwayaprah

MeSH: Escherichia coli

MeSH: Chitin

MeSH: Chitinase

Abstract: The gene encoding a chitinase from Bacillus circulans No.4.1 was subcloned into pQE30 expression vector and transformed into Escherichia coli M15 (pREP4). The chitinase from the transformant was purified by affinity chromatography on a nickel chelate resin. The molecular weight of the chitinase was determined to be approximately 66 kDa by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis. Chitinase was active toward crab shell chitin, carboxymethyl (CM)-chitin, colloidal chitin, glycol chitin and 4-methylumbelliferyl-β-D-N, N′- diacetylchitobiose [4-MU-(GlcNAc)2]. This enzyme hydrolyzes chitooligosaccharides to mainly chitobiose. The pH and temperature optima of the chitinase were 7.0 and 45°C, respectively. This enzyme was stable in the pH range of 5.0 to 9.0 and at temperatures up to 50°C. It was partially inhibited by 1 mM CdCl2, NiCl2, MnCl2, CuCl2, FeCl2, MgCl2, BaCl2, CaCl2, SDS and urea. The Km and Vmax values for 4- MU-(GlcNAc)2 were estimated to be 2.3 μM and 17 μmol/min/mg protein, respectively.

Abstract: ยีนสำหรับสร้างเอนไซม์ไคติเนสจากแบคทีเรียชนิด Bacillus circulans No.4.1 ได้ถูกตัด ต่อเชื่อมกับดีเอ็นเอพาหะ pQE30 และถูกแสดงออกในแบคทีเรียชนิด Escherichia coli M15 (pREP4) พบว่าโคลน pQE30-chi สามารถสร้างเอนไซม์ไคติเนสได้ในปริมาณสูง ดังนั้นจึงนำ เอนไซม์ที่ได้มาทำให้บริสุทธิ์ด้วยวิธี affinity chromatography โดยผ่านคอลัมน์ที่มี nickel chelate resin จากการทดลองสามารถแยกเอนไซม์ไคติเนสให้บริสุทธิ์ได้จำนวน 1 ชนิด โดยพิสูจน์ได้จาก การทำอิเลคโตรโฟเรซีสภายใต้สภาวะเสียสภาพ (SDS-PAGE) พบว่ามีน้ำหนักโมเลกุล 66 กิโลดาล ตัน นอกจากนี้ได้หาคุณสมบัติอื่นๆของเอนไซม์ไคติเนส โดยพบว่าเอนไซม์สามารถย่อยโมเลกุล ของสารตั้งต้นชนิด crab shell chitin, carboxymethyl (CM)-chitin, colloidal chitin, glycol chitin และ 4-methylumbelliferyl-β-D-N, N′-diacetylchitobiose [4-MU-(GlcNAc)2] ได้ และยังสามารถ ย่อยสลาย chitooligosaccharides เป็น chitobiose นอกจากนั้นยังพบว่าเอนไซม์สามารถเกิดปฏิกิริยา ได้ดีที่อุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียส และเกิดปฏิกิริยาได้ดีที่ pH 7.0 และยังพบว่าเอนไซม์ที่ได้นี้เสถียร ในช่วง pH 5.0 ถึง 9.0 และทนถึงอุณหภูมิที่ 50 องศาเซลเซียสได้ เมื่อทำการศึกษาผลของสารเคมีต่อ การทำงานของเอนไซม์พบว่าการทำงานของเอนไซม์ลดลงเมื่อมี ปริมาณ 1 มิลลิโมลาของ CdCl2, NiCl2, MnCl2, CuCl2, FeCl2, MgCl2, BaCl2, CaCl2, SDS และ urea และเมื่อใช้ 4-MU-(GlcNAc)2 เป็นสารซับเตรทพบว่ามีค่า Km เท่ากับ 2.3 ไมโครโมลา และค่า Vmax เท่ากับ 17 โมโครโมลต่อ นาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีน

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Chanpen Wiwat

Role: Thesis Advisors

Created: 2009-07-09

Modified: 2552-09-09

Issued: 2009-07-09

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740455271

CallNumber: TH P294pa 2004

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Biopharmaceutical Sciences

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4136389.pdf	1.64 MB	49	2023-07-08 16:38:37

ใช้เวลา

0.289305 วินาที