การโคลนและการแสดงออกของยีนกลูโคสไอโซเมอเรส จาก streptomyces sp.190-1 ใน escherichia coli

Cloning and expression of glucose isomerase gene from streptomyces sp.190-1 in Escherichia coli

Name: รัชนี ไสยประจง

ThaSH: โคลนิง

ThaSH: สเตรปโตมัยซิส

ThaSH: กลูโคสไอโซเมอเรส

ThaSH: เอสเคอริเคียโคไล

Abstract: ได้ทำการโคลนยีนกลูโคสไอโซเมอเรสจาก Streptomyces sp.190-1 ใน Escherichia coli HB101 โดยใช้พลาสมิด pUC18 หรือ pUC 19 เป็นพลาสมิดพาหะจากการคัดเลือกทรานสฟอร์แมนท์บนอาหารเลี้ยงเชื้อ MacConkey ager base ที่มีไซโลสและยาปฏิชีวนะแอมพิซิลลิน พบ 1 โคลน ที่มีความเสถียรให้ชื่อว่าโคลน 289 และรีคอมบิแนนต์พลาสมิดที่ได้ให้ชื่อว่า pUR289 เมื่อนำ E. coli HB101 ที่มีรีคอมบิแนนต์พลาสมิด pUR289 หรือพลาสมิด มาเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวสูตร LB ที่มีไซโลสเป็นองค์ประกอบ พบว่าแอคติวิตีจำเพาะของกลูโคสโอโซเมอเรสมีค่าเท่ากับ 27.9 และ 11.0 นาโนโมล/นาที/มก. ของโปรตีน ตามลำดับ เมื่อใช้ IPTG เป็นตัวเหนี่ยวนำในการสร้างเอนไซม์โดย E. coli HB101 ที่มีรีคอมบิแนนต์พลาสมิต pUR289 พบว่า มีแอคติวิตีจำเพาะเท่ากับ 33.3 นาโนโมล/นาที/มก.ของโปรตีน เมื่อทำการศึกษาขนาดของดีเอ็นเอทีใส่เข้าไป (inserted DNA) ในรีคอมบิแนนต์พลาสมิต pUR289 วิเคราะห์โดยอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟริซีส พบว่ามีขนาด 1.8 กิโลเบส จากการศึกษาแผนที่เรสทริกชั่น (Restriction map) พบว่ามีตำแหน่งตัดจำเพาะของเรสทริกขันเอนไซม์ BamHI HindIII และ PstI จากการทำโคลนย่อย พบว่าชึ้นส่วน HindIII มีความจำเป็นต่อการแสดงออกของยีน (gene expression) ในขณะที่ชิ้นส่วน EcoRI-PstI ไม่มีความจำเป็นต่อการแสดงออกของยีนและดีเอ็นเอขนาดเล็กที่สุดที่สามารถ แสดงออกได้มีขนาดประมาณ 1.4 กิโลเบส จากการทำ southern blot hybridization พบว่า ชิ้นส่วน PstI-XbaI ของดีเอ็นเอที่ใส่เข้าไปสามารถไฮบริไดซ์กับโครโมโซมอลดีเอ็นเอของ Streptomyces sp.109-1 ที่ตัดด้วย BamHI

Abstract: Glucose isomerase gene from Streptomyces sp.190-1 was cloned in Escherichia coli HB101 by using pUC18 or pUC19 as cloning vector. Ampicillin resistant transformants were selected on MacConkey agar base medium containing xylose as an inducer. One stable positive clone, namely clone 289, showing red colony which indicated the presence of glucose isomerase gene was obtained. The recombinant plasmid was designated as pUR289. Glucose isomerase activity of E. coli HB101 harboring pUR289 or pUC18 when cultivated in LB medium containing xylose were 27.9 and 11.0 nmol/min/mg of protein respectively. When E. coli HB101 harboring pUR289 was induced with IPTG, the specific activity of glucose isomerase was 33.3 nmol/min/mg of protein. Size of the DNA insert in pUR289 was determined by agarose gel electrophoresis to be approximately 1.8 kb. Restriction map of the DNA insert from this recombinant plasmid indicated that it contained at least one restriction site for each of BamHI, HindIII and PstI. Subcloning experiments indicated that HindIII-HinIII fragment of the insert DNA was essential for gene expression while EcoRI-BamHI and EcoRi-PstI fragments were not. The smallest size of the insert capable for gene expression was about 1.4 kb. Southern blot analysis revealed one perfect hybridized band between PstI-XbaI fragment of the insert and BamHI digested chromosomal DNA from Streptomyces sp.190-1

จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. สถาบันวิทยบริการ

Address: กรุงเทพมหานคร

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: ไพเราะ ปิ่นพานิชการ

Role: ที่ปรึกษา

Created: 2537

Modified: 2553-11-29

Issued: 2553-11-27

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9745838462

tha

DegreeName: วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต

Level: ปริญญาโท

Descipline: จุลชีววิทยาทางอุตสาหกรรม

Grantor: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

©copyrights จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	ratchanee_sa.pdf	7.26 MB	28	2019-10-20 20:15:51

ใช้เวลา

0.028535 วินาที