Cloning and characterzation of chitinase gene from hepatopancreas from black tiger shrimp Penaeus monodon

การโคลนและลักษณะสมบัติของยีนไคทิเนสที่ได้จากเฮพาโทแพนเครียสของกุ้งกุลาดำ Penaeus monodon

Name: Panutda Youdsang

LCSH: Molecular cloning

LCSH: Chitinase

LCSH: Penaeus monodon

Abstract: Chitinase (E.C. 3.2.1.14) is an enzyme that catalyzes the degradation of chitin. Chitinase is useful enzyme fo wide applications in several industries. A computer program was used for searching the chitinase gene in the black tiger shrimp (Penaeus monodon) database (http://pmonodon.biotec.or.th). A total of 10,100 clones were searched for chitinase gene. Three clones, two clones from a hemocyte library and another clone from hepatopancreas library, were identified as a putative chitinase gene and reconfirmed by BLASTN program. The chitinase gene, ChiHP74, found in hepatopancreas cDNA library of black tiger shrimp P. monodon has been cloned. The ChiHP74 contains an open reading frame of 1995 bp. The cDNA encoded for a polypeptide chain of 665 amino acid residues with a predicted molecular weight of 74 kDa. Sequence analysis of the deduced amino acid sequence of chitinase comprised a family 18 catalytic domain (CatD), a tachycitin like domain, and two proline rich domains at the C-terminus. In an expression of this gene, bacterial expression system and yeast expression system were used to express ChiHP74. The result showed this chitinase could not be expressed by both systems. Because of no expression of full-length fragment, CatD was chosen to clone and express instead. It was successfully expressed by using PET-17b in E. coli strain BL21 (DE3) called Chi-CatD which showed an optimum pH in two ranges of 4 and 7. The optimum temperature of this enzyme was 60degrees Celsius. Chi-CatD hydrolyzed B-chitin the best and only dimmer [(GlcNAc)2] was detected.

Abstract: ไคทิเนส (E.C. 3.2.1.14) เป็นเอนไซม์ที่เร่งปฏิกิริยาการย่อยสลายไคติน ไคติเนสสามารถนำมาประยุกต์ใช้ให้เกิดประโยชน์ต่ออุตสาหกรรมในด้านต่าง ๆ ในการศึกษาครั้งนี้ไคติเนสได้ถูกนำลักษณะสมบัติ โดยใช้โปรแกรมทางคอมพิวเตอร์เพื่อค้นหายีนไคติเนสจากฐานข้อมูลของห้องสมุด cDNA ของกุ้งกุลาดำ (http://pmonodon.biotec.or.th) ทั้งสิ้น 10,100 โคลน พบว่า 3 โคลนมีลำดับเบสเหมือนยีนไคทิเนส โดยได้จากห้องสมุดเม็ดเลือด 2 โคลน และ 1 โคลนจากห้องสมุด hepatopancreas ยีนที่ได้จากห้องสมุด hepatopancreas นี้ได้นำมาศึกษาต่อในการโคลนและแสดงออกของยีนไคทิเนส ไคทิเนสที่โคลนได้ถูกเรียกว่า ChiHP74 มี ope reading frame ขนาด 1995 bp ซึ่งแปลเป็นกรดอะมิโนได้ จำนวน 665 กรด อิมิโน มีน้ำหนักโมเลกุล 74 kDa จากการวิเคราะห์ลำดับเบส พบว่าไคทิเนสชนิดนี้ ประกอบด้วย catalytic domain (CatD) ในกลุ่มของไคทิเนสแฟมิลี่ 18 Tachycitin like domain และ domain และโดเมนที่มีกรดอะมิโนโพรลีนจำนวนมากที่ปลายทางด้านคาร์บอกซิลิก ในศึกษาการแสดงออกของ ChiHP74 ใน 2 ระบบ ได้แก่ การแสดงออกในแบคทีเรีย E. coli สายพันธุ์ GL21 (DE3) โดยใช้เวกเตอร์ pET-17b และการแสดงออกของยีนในแบคทีเรีย E. coli สายพันธุ์ BL21 (DE3) โดยใช้เวกเตอร์ pET-17b และการแสดงออกของยีนในยีสต์ Pichia pastoris โดยใช้เวกเตอร์ pPIC9K ผลการทดลองพบว่า ChiHP74 ไม่มีการแสดงออกในทั้ง 2 ระบบ จากนั้นทำการโคลนและศึกษาการแสดงออกของไคทิเนสเฉพาะบริเวณ catalytic domain (CatD) โดยศึกษาการแสดงออกในระบบของแบคทีเรีย E. coli สายพันธุ์ BL21 (DE3) ไคทิเนสที่โคลนได้นี้ถูกเรียกว่า Chi-CatD ประกอบไปด้วย open reading frame ขนาด 1278 bp แปลเป็นกรดอะมิโนได้จำนวน 426 กรดอะมิโน มีน้ำหนักโมเลกุล 48 kDa ผลการทดลองพบว่า Chi-CatD มี pH ที่เหมาะสมต่อการทำงานอยู่ สองช่วงคือ pH และ pH ส่วนอุณหภูมิที่เหมาะต่อการทำงานคือ 60 องศาเซลเซียส โดย Chi-CatD นี้สามารถย่อยเบต้าไคตินได้ดีที่สุดและให้ผลิตภัณฑ์หลักเป็นน้ำตาลโมเลกุลคู่

Chulalongkorn University

Address: BANGKOK

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: Rath Pichyangkura

Role: advisor

Email : prath@chula.ac.th

Name: Vichien Rimphanitchayakit

Role: advisor

Email : rvichein@chula.ac.th

Created: 2005

Modified: 2008-08-28

Issued: 2551-08-28

บทความ/Article

text/html

ISBN: 9741419422

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Biotechnology

Grantor: Chulalongkorn University

©copyrights Chulalongkorn University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	panutda.pdf	1.24 MB	59	2023-02-25 15:00:26

ใช้เวลา

0.020414 วินาที