Identification of growth-related molecular markers in the tropical abalone Haliotis asinina

การสืบค้นเครื่องหมายโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับการเติบโตของหอยเป๋าฮื้อเขตร้อน Haliotis asinina

Name: Thidarat Klongtruajroke

LCSH: Genetic markers

LCSH: Haliotis asinina -- Growth

Othors: Amplified fragment length polymorphism

Abstract: Growth-related DNA markers of abalone Haliotis asinina were identified by AFLP analysis. A total of 64 primer combinations was primarily screened with bulked genomic DNA of the first sample set, including fast growing (FG1, N = 10) and slow growing (SG1, N = 10) H. asinina. Forty candidate fast growing and 43 candidate slow growing related markers from 44 informative primers were further tested with both the first and the second sample set (FG2, N =10; SG2, N = 10). Only 2 candidate fast-growing and 7 candidate slow-growing related markers were found. To confirm the candidate markers, the third sample set (FG3, N = 10; SG3, N = 10) was tested but no growth-related markers was found. Then, 112 primer combinations were further used. As a result, one candidate of fast-growing related AFLP marker (225 bp) was found from primers Eco RI[subscript +3] 3 and Mse I[subscript +3] 12 (FGE3M12). However, the sequence of FGE3M13 did not show significant matching to the sequences previously deposited in the GenBank (E-value cut off of 10[superscript 4]). SCAR marker was developed from candidate growth-related markers. Primers were designed for PCR amplification in genomic DNA of fast growing (N = 9) and slow growing (N = 9) H. asinina. The primers generated the expected amplicon in both fast growing and slow growing H. asinina. Therefore, the single nucleotide polymorphism (SNP) was further determined by SSCP analysis. The result showed that the SCAR marker was polymorphic, but not growth linked. RAP-PCR analysis was carried out to isolate various types of expression markers in fast growing and slow growing H. asinina. Two slow-growing related expression markers were identified, SGRAP1 and SGRAP2 (210 bp and 260 bp respectively), through screening with 43 primer combinations. The two markers were generated from primers UBC101 and UBC191. SGRAP1 fragment showed a significant match to ADP/ATP carrier protein (E-value=10[superscript 17]), while the SGRAP2 fragment was homologue to inosine triphosphatase (E-value=10[superscript 7]). RT-PCR analysis was carried out using primers designed based on sequence of SGRAP1 and SGRAP2 markers. The analysis showed that the level of expression of SGRAP1 in slow-growing H. asinina was statistically significant than that of the fast-growing ones (p<0.05) and the level of expression of SGRAP2 in slow-growing H. asinina was obviously higher than that of the fast-growing ones. For the identification of insulin-related peptides homologue in H. asinina, using degenerated primers designed from insulin like peptides of the gastropod mollusks, Lymnaea stagnalis and Aplysia californica, the homologue in H. asinina was not identified

Abstract: จากการสืบค้นเครื่องหมายทางพันธุกรรมที่เกี่ยวข้องกับการเติบโตของหอยเป๋าฮื้อเขตร้อน Haliotis asinina ในระดับดีเอ็นเอ ด้วยเทคนิค AFLP โดยเบื้องต้นใช้ไพร์เมอร์จำนวน 64 คู่ไพร์เมอร์ และใช้ดีเอ็นเอต้นแบบที่มาจากการรวมดีเอ็นเอด้วยวิธี Bulked segregant analysis (BSA) ของหอยเป๋าฮื้อชุดที่ 1 ซึ่งแบ่งออกเป็น 2 กลุ่มคือ หอยเป๋าฮื้อที่เติบโตเร็ว (FG1, N=10) และหอยเป๋าฮื้อที่เติบโตช้า (SG1, N=10) พบเครื่องหมายที่คาดว่าน่าจะจำเพาะต่อหอยเป๋าฮื้อที่มีการเติบโตเร็ว และช้าจำนวน 40 และ 43 เครื่องหมายตามลำดับ จากไพร์เมอร์ 44 คู่ แล้วตรวจสอบเครื่องหมายดังกล่าวด้วยการเพิ่มตัวอย่างชุดที่ 2 (FG2, N=10; SG2, N=10) พบว่าเครื่องหมายที่เกี่ยวข้องกับการเติบโตนั้นมีจำนวนลดลง โดยแสดงการจำเพาะต่อหอยเป๋าฮื้อที่มีการเติบโตเร็วและช้าเป็นจำนวน 2 และ 7 เครื่องหมายตามลำดับ จากไพร์เมอร์ 7 คู่ และจากการเพิ่มชุดตัวอย่างชุดที่ 3 (FG3, N=10; SG3, N=10) เปรียบเทียบร่วมกับตัวอย่างชุดที่ 1 และชุดที่ 2 ไม่พบว่ามีเครื่องหมายใดที่แสดงความจำเพาะต่อหอยเป๋าฮื้อที่มีการเติบโตเร็วและช้า จึงได้เพิ่มจำนวนคู่ไพร์เมอร์อีก 112 คู่ โดยใช้ดีเอ็นเอตัวอย่างชุดที่ 1, 2 และ 3 เป็นดีเอ็นเอต้นแบบ พบเครื่องหมายที่จำเพาะกับหอยเป๋าฮื้อที่เติบโตเร็ว 1 เครื่องหมาย (FGE3M12) ที่มีขนาด 225 คู่เบส จากไพร์เมอร์ Eco RI[subscript +3]3 และ Mse I[subscript +3]12 เมื่อนำเครื่องหมายดังกล่าวมาหาลำดับนิวคลีโอไทด์ และนำไปเปรียบเทียบกับข้อมูลในฐานข้อมูล ไม่พบว่ามีความคล้ายกับยีนใดๆ ในฐานข้อมูลที่เคยมีรายงาน จากนั้นออกแบบไพร์เมอร์จากลำดับนิวคลีโอไทด์ของ FGE3M12 เพื่อเปลี่ยนให้เป็นเครื่องหมาย SCAR นำมาตรวจสอบกับหอยเป๋อฮื้อแต่ละตัวที่เติบโตเร็ว (N=9) และช้า (N=9) ด้วยปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส พบแถบดีเอ็นเอตามที่คาดหมายทั้งในหอยเป๋าฮื้อโตเร็วและช้า จึงนำมาตรวจสอบ single nucleotide polymorphism (SNP) ด้วยวิธี SSCP พบความแตกต่างในหอยเป๋าฮื้อแต่ละตัวทั้งที่เติบโตเร็วและช้า แต่ไม่พบ SNP ที่ใช้บ่งบอกความแตกต่างระหว่างหอยเป๋าฮื้อที่เติบโตเร็วและช้า สำหรับการสืบค้นเครื่องหมายทางพันธุกรรมที่มีการแสดงออกแตกต่างกันระหว่างหอยเป๋าฮื้อที่มีการเติบโตเร็วและช้าในระดับ cDNA ด้วยเทคนิค RAP-PCR โดยใช้ไพร์เมอร์ทั้งหมด 43 คู่ไพร์เมอร์ พบเครื่องหมายที่มีการแสดงออกในหอยเป๋าฮื้อที่เติบโตช้าจำนวน 2 เครื่องหมาย คือ SGRAP1 และ SGRAP2 โดยมีขนาด 210 และ 260 คู่เบส ตามลำดับ ซึ่งทั้งสองเครื่องหายนี้ถูกสร้างโดยใช้ไพร์เมอร์ UBC101 และ UBC191 นำเครื่องหมาย SGRAP1 และ SGRAP2 มาหาลำดับนิวคลีโอไทด์และนำไปเปรียบเทียบกับข้อมูลในฐานข้อมูล พบว่ามีความคล้ายกับยีน ADP/ATP carrier protein (E=va;ue=10[superscript -17] และ Inosine triphosphatase (E=value=10 [superscipt -7] ตามลำดับ เมื่อออกแบบไพร์เมอร์จากเครื่องหมายทั้งสองเพื่อตรวจสอบการแสดงออกที่แตกต่างกันระหว่างหอยเป๋าฮื้อที่เติบโตเร็ว (N=5) โดยใช้วิธี RT-PCR พบว่า ไพร์เมอร์ที่ออกแบบจากเครื่องหมายทั้งสองนั้น สามารถบ่งบอกการแสดงออกที่แตกต่างกันระหว่างหอยเป๋าฮื้อที่เติบโตเร็วและช้าได้ โดยไพร์เมอร์ที่ได้จาก SGRAP1 ให้ผลของการแสดงออกในหอยเป๋าฮื้อที่เติบโตช้ามากว่าหอยเป๋าฮื้อที่เติบโตเร็วอย่างมีนัยสำคัญ (p<0.05) และเช่นเดียวกัน ไพร์เมอร์ที่ได้จาก SGRAP2 ให้ผลการของการแสดงออกในหอยเป๋าฮื้อที่เติบโตเร็วอย่างชัดเจน ในการค้นหายีน insulin-related peptide ในหอยเป๋าฮื้อด้วยปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส โดยใช้ไพร์เมอร์ที่ออกแบบมาจากบริเวณที่ conserved ของลำดับกรดอะมิโนของ insulin-related peptide จากหอย Aplysia californica และ Lymnaea stagnalis ในฐานข้อมูล พบว่าลำดับนวิคลีโอไทด์ที่ได้ไม่เหมือนกับยีน insulin-related peptide ในฐานข้อมูล

Chulalongkorn University

Address: กรุงเทพมหานคร (Bangkok)

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: Anchalee Tassanakajon

Role: Advisor

Name: Sira wut Klinbunga

Role: Advisor

Created: 2004

Issued: 2006-02-27

Modified: 2006-05-01

วิทยานิพนธ์/Thesis

URL: http://thailis-db.car.chula.ac.th/CU_DC/Thesis/February2006/Thidarat.pdf

ISBN: 9745312517

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Biotechnology

Grantor: Chulalongkorn University

©copyrights Chulalongkorn University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	Thidarat.pdf	2.12 MB	34	2019-09-06 00:07:54

ใช้เวลา

0.04513 วินาที