Production of recombinant antibododies against plasma membrane epitopes on y-chromosome-bearing sperm by phage display technology for sexed boar semen

การผลิตรีคอมบิแนนท์แอนติบอดีจำเพาะต่ออิพิโทปของพลาสมาเมมเบรนของเซลล์อสุจิที่มีโครโมโซมวายของสุกรโดยใช้เทคนิคฟาจดิสเพลย์ เพื่อผลิตน้ำเชื้อสุกรคัดแยกเพศ

Name: Marninphan Thongkham

LCSH: Swine -- Breeding

LCSH: Boars

LCSH: Semen

LCSH: Y Chromosome

Abstract: This study aimed to develop and apply a single-chain variable fragment (scFv) antibody targeting porcine Y-chromosome-bearing sperm (Y-sperm) for the effective sexing of swine sperm. The research was divided into two parts: the production of the scFv antibody targeting porcine Y-sperm and its application in sperm sexing. In the first study, the goal was to generate a recombinant scFv antibody specific to the plasma membrane epitope of porcine Y-sperm. Initially, hybridoma technology was employed to screen and identify a monoclonal antibody (mAb), clone 4D1-E8, which demonstrated strong specificity for Y-sperm. Total RNA was extracted from the 4D1-E8 hybridoma, and cDNA was synthesized to amplify the variable regions of the heavy (VH, ~450 bp) and light (VL, ~300 bp) chains. These sequences were then genetically linked using a (G₄S)₃ flexible linker to create a 795 bp scFv gene. The gene was inserted into the pET-22b(+) expression vector under the control of a T7 promoter and transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) for protein expression. The H4:L4 clone successfully expressed a soluble scFv antibody, which was purified and confirmed by SDS-PAGE and Western blotting. Functional assays using ELISA and flow cytometry showed that the H4:L4 scFv strongly bound to Y-sperm with minimal cross-reactivity to X-sperm (4.14%), significantly lower than the original 4D1-E8 mAb (15.5%). Immunofluorescence microscopy confirmed that both antibodies localized on the plasma membrane of Y-sperm, indicating successful targeting. Cross-reactivity with semen from other livestock species was also observed, the scFv antibody exhibited strong cross-reactivity with boar (100%), bull (29.4%), ram (15.2%), and buffalo (38.8%) semen.In the second study, the H4:L4 scFv antibody was applied for practical sperm sexing using magnetic-activated cell sorting (MACS). The scFv was covalently conjugated to polylactic acid (PLA) microbeads via carboxylic acid groups, forming HL-beads. Successful antibody conjugation to the bead surface was confirmed using Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR), while scanning electron microscopy (SEM) was employed to visualize sperm bound to the functionalized microbeads. For the sperm sexing procedure, fresh semen collected from Duroc boars (n = 3) was divided into three equal groups: conventional semen (CONV), negative control (NC), and a group subjected to sex-sorting using HL-beads. The HL-bead-treated group was further separated into two subgroups: the X-enriched fraction (XF) and the Y-enriched fraction (YF). All sperm samples were stored at 17 °C for five days and evaluated for quality parameters on Days 0, 1, 3, and 5 post-sorting using imaging flow cytometry and computer-assisted sperm analysis (CASA). Additionally, the sex ratio of sperm cells in each fraction was determined. The sex-sorting process achieved enrichment efficiencies of 75.4 ± 2.30% for X-sperm in the XF and 78.6 ± 1.94% for Y-sperm in the YF, as assessed by imaging flow cytometry. Sperm quality evaluations showed that the XF maintained motility, viability, plasma membrane integrity, and acrosome integrity comparable to the CONV and NC groups. In contrast, a noticeable decline in sperm quality was observed in the YF by Day 3 of storage. Apoptosis assays revealed no significant differences in the percentage of necrotic sperm cells among the XF, CONV, and NC groupsIn conclusion, this study successfully generated a novel, soluble scFv antibody (H4:L4) with high specificity for porcine Y-sperm and demonstrated its application in MACS-based sperm sexing. The method enables efficient enrichment of X- or Y-sperm populations while maintaining acceptable sperm quality for artificial insemination. These findings provide a promising foundation for the further development of antibody-based sperm sexing technologies in swine production, offering potential improvements in reproductive efficiency and gender-specific breeding strategies.

Abstract: วัตถุประสงค์ของการศึกษานี้เพื่อพัฒนาและประยุกต์ใช้รีคอมบิแนนท์แอนติบอดี (single-chain variable fragment: scFv) ที่มีความจำเพาะต่ออสุจิที่มีโครโมโซมวายสุกร (Y-sperm) เพื่อการคัดแยกเพศอสุจิสุกรอย่างมีประสิทธิภาพ การวิจัยแบ่งออกเป็นสองส่วน ได้แก่ การผลิตแอนติบอดี scFv ที่มีความจำเพาะต่อที่มีโครโมโซมวายสุกร และการประยุกต์ใช้ scFvในการคัดแยกเพศอสุจิสุกร ในการศึกษาแรกมีเป้าหมายเพื่อสร้างรีคอมบิแนนท์แอนติบอดีที่จำเพาะต่ออิพิโทปบนเยื่อหุ้มเซลล์พลาสมาของอสุจิวายของสุกร โดยเริ่มจากการผลิตเซลล์ลูกผสม (hybridoma) เพื่อคัดเลือกและระบุโมโนโคลนอลแอนติบอดี (monoclonal antibody: mAb) ที่มีความสามารถในผลิตแอนติบอดีที่ความจำเพาะสูงต่อเซลล์อสุจิวายสุกร โดยพบว่าที่โคลน 4D1-E8 ซึ่งแสดงความจำเพาะอย่างยิ่งต่ออสุจิวายสุกร จากนั้นทำการสกัดอาร์เอ็นเอทั้งหมด (total RNA) จากเซลล์ไฮบริโดมา 4D1-E8 และสังเคราะห์ซีดีเอ็นเอ (cDNA) เพื่อเพิ่มปริมาณส่วนแปรผัน (variable regions) ของสายหนัก (heavy chain: VH, ประมาณ 450 คู่เบส) และสายเบา (light chain: VL, ประมาณ 300 คู่เบส) ลำดับเบสเหล่านี้ถูกเชื่อมต่อเข้าด้วยกันโดยด้วย flexible linker ชนิด (G₄S)₃ เพื่อสร้างยีน scFv ขนาด 795 คู่เบส ยีนดังกล่าวถูกใส่เข้าไปในพลาสมิดสำหรับแสดงออก (expression vector) pET-22b(+) ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ T7 (T7 promoter) และถ่ายทอดเข้าไปในเชื้อ Escherichia coli สายพันธุ์ BL21 (DE3) เพื่อการแสดงออกของโปรตีน โคลน H4:L4 สามารถแสดงออกแอนติบอดี scFv ที่ละลายน้ำได้ (soluble scFv antibody) สำเร็จ ซึ่งถูกทำให้บริสุทธิ์และยืนยันผลด้วยเทคนิค SDS-PAGE และ Western blotting นอกจากนี้การทดสอบความจำเพาะต่อเซลล์อสุจวายสุกรโดยใช้เทคนิค ELISA และโฟลไซโตเมทรี (flow cytometry) แสดงให้เห็นว่า H4:L4 scFv สามารถจับกับอสุจิ Y ได้อย่างจำเพาะเจาะจง โดยมีปฏิกิริยาเกาะเกี่ยว (cross-reactivity) กับอสุจิที่มีโครโมโซมเอ็กซ์ในระดับต่ำ (4.14%) และเมื่อเปรีบเทียบกับ 4D1-E8 mAb พบว่าปฏิกิริยาเกาะเกี่ยวน้อยกว่า (4.14% vs 15.5%) อย่างมีนัยสำคัญ อีกทั้งการตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์อิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ (Immunofluorescence microscopy) ยืนยันว่า H4:L4 scFv และ 4D1-E8 mAb ปรากฏอยู่บนเยื่อหุ้มเซลล์พลาสมาของอสุจิ Y ซึ่งบ่งชี้ถึงความสำเร็จในการจับเป้าหมาย นอกจากนี้ยังพบปฏิกิริยาข้ามกับน้ำเชื้อจากปศุสัตว์ชนิดอื่น โดยแอนติบอดี H4:L4 scFv แสดงปฏิกิริยาข้ามอย่างชัดเจนกับน้ำเชื้อของพ่อสุกร (100%), โค (29.4%), แกะ (15.2%) และกระบือ (38.8%)ในการศึกษาที่สอง แอนติบอดี H4:L4 scFv ถูกนำมาประยุกต์ใช้สำหรับการคัดแยกเพศอสุจิสุกรร่วมกับเทคนิคการคัดแยกเซลล์ด้วยแม่เหล็ก (magnetic-activated cell sorting: MACS) โดย scFv ถูกเชื่อมต่อด้วยพันธะโคเวเลนต์ (covalently conjugated) กับไมโครบีดส์พอลิแลคติกแอซิด (polylactic acid: PLA) ผ่านหมู่คาร์บอกซิลิกแอซิด (carboxylic acid groups) ได้เป็น HL-beads การเชื่อมต่อแอนติบอดีเข้ากับพื้นผิวบีดส์ที่ประสบความสำเร็จได้รับการยืนยันโดย Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) และยืนยันด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด (scanning electron microscopy: SEM) เพื่อแสดงภาพเซลล์อสุจิที่จับอยู่กับ HL-beads นอกจากนี้ในกระบวนประยุกต์ใช้ HL-beads เพื่อการคัดแยกเพศอสุจิ โดยทำเก็บตัวอย่างการน้ำเชื้อสดจากพ่อสุกรพันธุ์ดูร็อก (Duroc boars) จำนวน 3 ตัว (n = 3) ถูกแบ่งออกเป็นสามกลุ่มการทดลอง คือ กลุ่มน้ำเชื้อปกติ (conventional semen: CONV), กลุ่มควบคุมเชิงลบ (negative control: NC) และกลุ่มที่ผ่านการคัดแยกเพศโดยใช้ HL-beads โดยที่กลุ่มที่ผ่านการคัดแยกด้วย HL-beads ถูกแยกต่อไปเป็นสองกลุ่มย่อย: กลุ่มที่มีสัดส่วนเซลล์อสุจิเอ็กซ์สูง (X-enriched fraction: XF) และกลุ่มที่มีสัดส่วนเซลล์อสุจิวายสูง (Y-enriched fraction: YF) ตัวอย่างอสุจิจากทุกกลุ่มการทดลองถูกเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 17 องศาเซลเซียส และประเมินคุณภาพของเซลล์อสุจิในวันที่ 0, 1, 3 และ 5 หลังการคัดแยก ด้วย imaging flow cytometry และcomputer-assisted sperm analysis (CASA) นอกจากนี้ทำการประเมินสัดส่วนเพศของเซลล์อสุจิในทุกกลุ่มการทดลอง จากการศึกษาพบว่ากระบวนการคัดแยกเพศเซลล์อสุจิสุกร ประสบความสำเร็จในการเพิ่มความสัดส่วนของอสุจิเอ็กซ์ ในส่วน XF ได้ 75.4±2.30% และอสุจิวายในส่วน YF ได้ 78.6±1.94% อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติเมื่อเปรียบเทีบกับ CONV และ NC (P < ; 0.05) นอกจากนี้การประเมินคุณภาพอสุจิแสดงให้เห็นว่าส่วน XF สามารถรักษาการเคลื่อนที่ อัตราความมีชีวิต ความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มเซลล์พลาสมา และความสมบูรณ์ของอะโครโซม ได้ในระดับที่เทียบเท่ากับกลุ่ม CONV และ NC ในทางตรงกันข้าม พบการลดลงของคุณภาพอสุจิอย่างเห็นได้ชัดในส่วน YF ภายในวันที่ 3 ของการเก็บรักษา (P < ; 0.05) การทดสอบอะพอพโทซิส (apoptosis assays) พบว่าไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในเปอร์เซ็นต์ของเซลล์อสุจิที่ตายแบบเนโครซิส (necrotic sperm cells) ระหว่างกลุ่ม XF CONV และ NCงานวิจัยนี้ประสบความสำเร็จในการสร้างแอนติบอดี scFv ชนิดใหม่ (H4:L4) ซึ่งมีความจำเพาะสูงต่ออสุจิวายของสุกรสูง และแสดงให้เห็นถึงเมื่อนำมาประยุกต์ใช้ในการคัดแยกเพศอสุจิร่วมกับเทคนิค MACS วิธีการนี้ช่วยให้สามารถเพิ่มสัดส่วนของประชากรอสุจิที่มีโครโมโซมเอ็กซ์หรือโครโมโซมวาย ได้อย่างมีประสิทธิภาพ ในขณะที่ยังคงรักษาคุณภาพอสุจิให้อยู่ในระดับที่ยอมรับได้สำหรับการผสมเทียม ผลการวิจัยเหล่านี้เป็นพื้นฐานที่มีแนวโน้มที่ดีสำหรับการพัฒนาต่อไปของเทคโนโลยีการคัดแยกเพศอสุจิโดยใช้แอนติบอดีในการผลิตสุกร

Chiang Mai University. Library

Address: CHIANG MAI

Email: cmulibref@cmu.ac.th

Name: Korawan Sringarm

Role: Advisor

Name: Supamit Mekchay

Role: Advisor

Name: Anucha Sathanawongs

Role: Advisor

Name: Surat Hongsibsong

Role: Advisor

Created: 2025

Modified: 2025-08-08

Issued: 2025-08-08

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Animal Science

Grantor: Chiang Mai University

©copyrights Chiang Mai University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	640851003.pdf	586.46 KB

ใช้เวลา

0.03785 วินาที