Development of immunoassay for detecting fluoroquinolones antibiotics and application in food material

การพัฒนาวิธีอิมมิวโนแอสเสย์สําหรับตรวจหายาปฏิชีวนะฟลูออโรควิโนโลน และการประยุกต์ในตัวอย่างวัตถุดิบอาหาร

Name: Sumed Yadoung

LCSH: Immunoassay

LCSH: Antibiotics

LCSH: Fluoroquinolones

LCSH: Food

Abstract: งานวิจัยนี้มุ่งเน้นการพัฒนาชุดทดสอบภูมิคุ้มกัน (immunoassay) สำหรับตรวจหาสารตกค้างของยาปฏิชีวนะกลุ่มฟลูออโรควิโนโลน (fluoroquinolone: FQ) ในผลิตภัณฑ์จากสัตว์ เพื่อตอบสนองต่อประเด็นความปลอดภัยของอาหารจากการใช้ยาปฏิชีวนะอย่างแพร่หลายในอุตสาหกรรมปศุสัตว์ของไทย โดยเฉพาะยาอะม็อกซีซิลลินและเอนโรฟลอกซาซิน การใช้ยาปฏิชีวนะอย่างเกินขนาดนำไปสู่การตกค้างที่เป็นอันตรายในเนื้อสัตว์และเพิ่มการดื้อยาของแบคทีเรีย เราได้พัฒนาชุดทดสอบ ELISA แบบแข่งขันทางอ้อม (indirect competitive ELISA หรือ icELISA) สำหรับตรวจวัดสารตกค้างของยากลุ่มนี้ โดยใช้แอนติบอดี IgY ที่สกัดจากไข่แดงของแม่ไก่ที่ได้รับการสร้างภูมิคุ้มกันด้วยไซโปรฟลอกซาซิน-บีเอสเอ (CPFX-BSA) และนอฟลอกซาซิน-บีเอสเอ (NFX-BSA) ชุดทดสอบนี้แสดงความไวสูงด้วยค่า IC50ของเอนโรฟลอกซาซินที่ 50 µg/kg ซึ่งต่ำกว่าค่าปริมาณตกค้างสูงสุด (MRL) ที่กำหนดโดยสหภาพยุโรปที่ 100 µg/kg ในตัวอย่างเนื้อสัตว์ และทดสอบพบอัตราการคืนกลับของสารในตัวอย่างเนื้อไก่และหมูที่เติมสารตกค้าง ซึ่งมีช่วง 86.65–112.71% และ 84.24–117.22% ตามลำดับ แสดงให้เห็นถึงความแม่นยำและความเชื่อถือได้ในการตรวจหาอย่างรวดเร็วนอกจากนี้ ได้มีการพัฒนาชุดทดสอบ ELISA แบบให้สีใหม่ที่ใช้สารโดพามีนเป็นสารสร้างสี ในสภาวะที่มีเอนไซม์ horseradish peroxidase (HRP) และไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (H2O2) ซึ่งกระตุ้นให้เกิดการพอลิเมอไรเซชันของโดพามีนและเกิดการเปลี่ยนแปลงสีที่สังเกตได้ ชุดทดสอบนี้แสดงความไวที่ดีขึ้นในการตรวจหาเอนโรฟลอกซาซิน โดยมีค่า IC50ที่ 26 µg/kg ซึ่งดีกว่าการใช้สารให้สีแบบดั้งเดิมอย่าง o-phenylenediamine ที่มีค่า IC50ที่ 50 µg/kg การตอบสนองเชิงสีที่เพิ่มขึ้นจากการพอลิเมอไรเซชันของโดพามีน เมื่อเทียบกับคาเทคอล ช่วยเพิ่มความสามารถในการตรวจวัดและความไวของชุดทดสอบยิ่งกว่านั้น มีการพัฒนาและปรับปรุงชุดทดสอบแถบไหลด้านข้างแบบขั้นตอนเดียว (lateral flow immunochromatographic assay หรือ LFIA) สำหรับตรวจหาไซโปรฟลอกซาซินอย่างรวดเร็ว โดยปรับพารามิเตอร์ที่สำคัญ เช่น ค่า pH องค์ประกอบของบัฟเฟอร์ และความเข้มข้นของแอนติบอดี/แอนติเจน ซึ่งให้ค่า IC50 ที่เหมาะสมที่ 35.22 mg/kg และแสดงความจำเพาะสูงต่อไซโปรฟลอกซาซิน อย่างไรก็ตาม พบการรบกวนของสารตัวอย่างจากเนื้อหมูและไก่ ซึ่งบ่งชี้ว่าจำเป็นต้องมีขั้นตอนเตรียมตัวอย่างเพิ่มเติมเพื่อให้ได้ผลที่แม่นยำในตัวอย่างที่ซับซ้อนชุดทดสอบภูมิคุ้มกันที่พัฒนานี้แสดงถึงวิธีการที่มีประสิทธิภาพ ไวต่อการตรวจวัด และคุ้มค่าในการตรวจหาสารตกค้างของยาปฏิชีวนะกลุ่ม FQ ในสถานที่ใช้งานจริง และเน้นถึงศักยภาพของวิธีที่ใช้ IgY ในการรับรองความปล

Abstract: This research focuses on developing immunoassays to detect fluoroquinolone (FQ) antibiotic residues in animal products, addressing a major food safety concern due to the extensive use of antibiotics like amoxicillin and enrofloxacin in Thai livestock farming. Overuse of these antibiotics has led to harmful residues in meat products and increased bacterial resistance. We developed an indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (icELISA) to monitor these residues efficiently, using IgY antibodies extracted from egg yolks of hens immunized with ciprofloxacin-bovine serum albumin (CPFX-BSA) and norfloxacin-bovine serum albumin (NFX-BSA). This IgY-based assay showed excellent sensitivity with an IC₅₀ of 50 µg/kg for enrofloxacin, well below the EU\'s maximum residue limit (MRL) of 100 µg/kg for muscle samples. The test showed high recovery rates in spiked chicken and pork samples, with ranges of 86.65–112.71% and 84.24–117.22%, respectively. This shows that it can be trusted to find residues quickly and accurately.In addition, a novel colorimetric ELISA was developed using dopamine as a color-generating reagent in the presence of horseradish peroxidase (HRP) and H 2 O 2 , which induced dopamine polymerization and a visible color change. This dopamine-based assay showed improved sensitivity for detecting enrofloxacin, achieving an IC₅₀ of 26 µg/kg, a significant enhancement over traditional colorimetric reagents like o-phenylenediamine, which has an IC₅₀ of 50 µg/kg. The stronger colorimetric response from dopamine’s polymerization, compared to catechol, led to greater absorbance changes, and increased assay sensitivity. Furthermore, a one-step lateral flow immunochromatographic assay (LFIA) was developed to rapidly detect ciprofloxacin. This LFIA was optimized by adjusting parameters such as pH, buffer composition, and antibody/antigen concentrations. With an optimized IC₅₀ of 35.22 mg/kg, the assay exhibited high specificity for ciprofloxacin. However, we observed matrix interference from pig and chicken extracts, indicating additional sample preparation steps needed to ensure accurate results in complex samples. These developed immunoassays demonstrate effective, sensitive, and cost-efficient approaches for on-site detection of FQ antibiotic residues, highlighting the potential of IgY-based methods in ensuring food safety and monitoring antibiotic residues in food products.

Chiang Mai University. Library

Address: CHIANG MAI

Email: cmulibref@cmu.ac.th

Name: Surat Hongsibsong

Role: Advisor

Name: Korawan Sringarm

Role: Advisor

Name: Mookda Pattarawarapan

Role: Advisor

Name: Somporn Chantara

Role: Advisor

Name: Zhen-Lin Xu

Role: Advisor

Name: Ryoichi Ishimatsu

Email : Advisor

Created: 2024

Modified: 2025-01-16

Issued: 2025-01-16

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Environmental Science

Grantor: Chiang Mai University

©copyrights Chiang Mai University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	640555906.pdf	1.27 MB

ใช้เวลา

0.047743 วินาที