Screening of bacteriocin producing Bacillus spp. isolated from Miang for application as probiotic in nile tilapia culture

การคัดกรอง Bacillus spp. ที่สร้างแบคเทอริโอซินจากเมี่ยงเพื่อการประยุกต์ใช้เป็นโพรไบโอติกในการเพาะเลี้ยงปลานิล

Name: Anyairo, Chioma Stella

LCSH: Nile tilapia -- Feeding and feeds

LCSH: Nile tilapia -- Cultures (Biology)

LCSH: Bacillus (Bacteria)

LCSH: Probiotics

Abstract: Seventy-nine Bacillus strains isolated from Miang samples were screened for potential probiotics for applying in aquaculture. Only six strains of Bacillus spp. (K2.1, K6.1, K7.1, K15.4 and K22.6, and K29.2) were revealed the antimicrobial ability against Gram-negative Aeromonas hydrophila and Gram-positive Streptococcus agalactiae. Through the molecular identification by 16S rRNA gene sequence and phylogenetic analysis, five isolates were identified to be Bacillus tequilensis (K2.1, K6.1, K7.1, K15.4, and K22.6) and the remaining isolate K29.2 was Bacillus siamensis. All selected isolates were susceptible to some tested antibiotics via agar well diffusion assay, except for B. tequilensis K6.1 and B. tequilensis 15.4, which were slightly resistant to streptomycin. In addition, they were all resistant to 0.3% (w/v) bile salt with a reasonable survival rate against extreme pH and secreted extracellular proteolytic enzymes. B. tequilensis K15.4 and B. siamensis K29.2 were selected to study for tannin tolerance and polysaccharides degrading enzyme production owing to their high tolerance to the gastric simulated and 0.3% (w/v) bile salt conditions. The time course study across 24 h on submerged fermentation using the specific enzyme inducer of each 0.5% (w/v) of carboxymethyl cellulose (CMC), birch wood xylan and locust bean gum (LBG), independently, revealed their ability to secret cellulase, xylanase and β-mannanase with the overall enzyme activity of B. tequilensis K15.4 higher than B. siamensis K29.2. The tannin tolerance analysis showed that two selected strains exhibited the the ability to grow and secrete cellulase and β-mannanase in the presence of hydrolysable tannin. Therefore, these characteristics supported their potential to be applied as multifunctional probiotic strains in Nile tilapia cultivation. The growth dynamics study of B. tequilensis K15.4 and B. siamensis K29.2 showed the optimum bacteriocin-producing time at 24 h cultivation at 37C, and the final pHs are 8.13 and 8.3, respectively. Antimicrobial activity reduction of culture supernatants after incubation with proteinase K reaffirmed their proteinaceous nature of bacteriocin from both strains. Purification of bacteriocins from both selected strains by 80% ammonium sulfate precipitation and gel filtration using 26/60 Sephacryl S100HR column revealed that the native molecular weight of the bacteriocin from B. tequilensis K15.4 and B. siamensis K29.2 were estimated to be 23 and 25 kDa, respectively. However, the exact elucidation of the authentic bacteriocins from both selected bacillus strains have to be clarified by more efficient SDS-PAGE or other analytical techniques. The purified bacteriocins from both two selected B. tequilensis K15.4 and B. siamensis K29.2 demonstrated broad pH tolerance and thermostability, demonstrating bactericidal inhibition against A. hydrophila cell growth, and retaining antimicrobial activity over a storage time of at least four months in a lyophilized form.

Abstract: จากการคัดเลือกแบคทีเรียบาซิลลัสจํานวนทั้งหมด 79 ไอโซเลตทีแยกได้จากตัวอย่างเมียง เพื่อหาแบคทีเรียโพรไบโอติกทีมีศักยภาพในการนําไปใช้ในการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ พบว่ามีแบคทีเรียบาซิลลัสเพียง 6 ไอโซเลตเท่านั้น (K2.1, K6.1, K7.1, K15.4 และ K22.6 และ K29.2) ที่แสดงความสามารถในการต้านจุลชีพแบคทีเรียแกรมลบ Aeromonas hydrophila และแบคทีเรียแกรมบวก Streptococcus agalactiae การจัดจําแนกโดยการวิเคราะห์ลําดับของยีน 16S rRNA และแผนภูมิวิวัฒนาการพบว่า 5 ไอโซเลต จัดจําแนกเป็น Bacillus tequilensis (K2.1, K6.1, K7.1, K15.4 และ K22.6) และไอโซเลต K29.2 ที่เหลือคือ Bacillus siamensis การทดสอบความไวต่อยาปฏิชีวนะโดยวิธี Agar well diffusion พบว่าเชื้อที่ได้รับการคัดเลือกทั้งหมดมีความไวต่อยาปฏิชีวนะทีทดสอบ ยกเว้น B. tequilensis K6.1 และ B. tequilensis 15.4 ที่พบการต้านทานต่อสเตรปโตมัยซินเล็กน้อย นอกจากนี้ แบคทีเรียบาซิลลัสทั้ง 6 ชนิดสามารถทนต่อเกลือน้ำดีที่ความเข้มข้น 0.3% (w/v) โดยมีอัตราการรอดที่เหมาะสมต่อค่า pH ที่สูงเกินไป และสามารถหลังเอนไซม์ย่อยโปรตีนชนิดที่หลังออกมานอกเซลล์ได้ เนื่องจากคุณสมบัติในการทนทานต่อสภาวะจําลองในกระเพาะอาหารที่มีเกลือน้ำดีเข้มข้น 0.3% (w/v) แบคทีเรีย B. tequilensis K15.4 และ B. siamensis K29.2 ได้รับการคัดเลือกเพื่อศึกษาการทนทานต่อแทนนินและความสามารถในการผลิตเอนไซม์ย่อยสลายพอลิแซ็กคาไรด์ ผลการศึกษา การผลิตเอนไซม์ในการเพาะเลี้ยงในอาหารเหลวทีอุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง โดยใช้ตัวเหนี่ยวนําจําเพาะสําหรับการผลิตเอนไซม์แต่ละชนิดเข้มข้น 0.5% (w/v) ประกอบด้วยคาร์บอกซีเมทิลเซลลูโลส (CMC) ไซแลนจากไม้เบิร์ช และโลคัสบีนกัม (LBG) ผลการศึกษาพบว่าแบคทีเรียทั้งสองชนิดสามารถผลิตเอนไซม์เซลลูเลสของพวกมัน, ไซลาเนส และ บีต้า-แมนนาเนสโดยตรวจพบค่ากิจกรรมเอนไซม์โดยรวมของ B. tequilensis K15.4 ในปริมาณสูงกว่าเอนไซม์ทีสร้างจาก B. siamensis K29.2 การวิเคราะห์ความทนทานต่อแทนนินแสดงให้เห็นว่าแบคทีเรียบาซิลลัสทั้งสองสายพันธุ ์แสดงความสามารถในการเจริญและสร้างเซลลูเลสและ บีต้า-แมนนาเนสในสภาวะที่มีแทนนินได้ คุณลักษณะเหล่านี้แสดงให้เห็นศักยภาพในการนําไปประยุกต์ใช้เป็นโปรไบโอติกในการเพาะเลี้ยงปลานิล การศึกษาพลวัตการเจริญของ B. tequilensis K15.4 และ B. siamensis K29.2 พบว่าเวลาที่เหมาะสมในการผลิตแบคเทอริโอซินทีเหมาะสมคือการเพาะเลียงทีอุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และค่า pH สุดท้ายคือ 8.13 และ 8.3 ตามลําดับ การลดลงของฤทธิต้านจุลชีพในน้ำเลี้ยงที่ได้จาก การเพาะเลี้ยงโปรตีเนส K ยืนยันคุณสมบัติการเป็นโปรตีนของแบคเทอริโอซินจากทังสองสายพันธุ์ การทําบริสุทธิแบคเทอริโอซินบริสุทธิจากแบคทีเรียทั้งสองสายพันธุ์ด้วยการตกตะกอนแอมโมเนียมซัลเฟต 80% และโครมาโทกราฟีแบบเจลฟิลเตรชันโดยใช้คอลัมน์ 26/60 Sephacryl S100HR พบว่าน้ำหนักโมเลกุลของ แบคเทอริโอซินจาก B. tequilensis K15.4 และ B. siamensis K29.2 มีขนาดประมาณ 23 และ 25 kDa ตามลําดับ อย่างไรก็ตาม การศึกษายืนยันขนาดโมเลกุลที่แน่นอนของแบคเทอริโอซินจากบาซิลลัสทั้งสองสายพันธุ ์โดย SDS-PAGE หรือเทคนิคการวิเคราะห์อื่นๆ ที่มีประสิทธิภาพมากขึ้นเป็นสิ่งที่จําเป็นต่อการศึกษาเพิมเติม แบคเทอริโอซินบริสุทธิจาก B. tequilensis K15.4 และ B. siamensis K29.2 แสดงให้เห็นสมบัติความทนทานต่อค่าการเปลียนแปลง pH และความเสถียรต่ออุณหภูมิในช่วงกว้าง นอกจากนีแบคเทอริโอซินทีทําบริสุทธิแสดงความสามารถในการยับยังการเจริญของเซลล์แบคทีเรีย A. hydrophila และสามารถคงฤทธิต้านจุลชีพไว้ได้ตลอดระยะเวลาการเก็บรักษาในรูปแบบผงแห้งจากการทําแห้งแบบ การดึงนําออกในสภาวะเยือกแข็งเป็นเวลาอย่างน้อยสี่เดือน

Chiang Mai University. Library

Address: CHIANG MAI

Email: cmulibref@cmu.ac.th

Name: Chartchai Khanongnuch

Role: Advisor

Created: 2023

Modified: 2024-01-08

Issued: 2024-01-08

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Biotechnology

Grantor: Chiang Mai University

©copyrights Chiang Mai University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	649931002.pdf	2.19 MB	12	2026-05-26 18:16:01

ใช้เวลา

0.036822 วินาที