Isolation of elephant endotheliotropic herpesviruses in Asian Elephants (Elephas maximus)

การเพาะแยกเชื้อเฮอร์ปีส์ไวรัสในช้างเอเชีย (Elephas maximus)

Name: Kornravee Photichai

LCSH: Asiatic elephant

LCSH: Herpesvirus diseases

ThaSH: Herpesviruses

Abstract: Elephant endotheliotropic herpesviruses (EEHV) infection causes an acute fatal hemorrhagic disease, which brought terribly lost in young Asian elephants (Elephas maximus). Recently, in vitro isolation and propagation of the virus is not successful. This study aims to isolate and propagate the EEHV using the continuous cell lines, derived from human or animal origins. The human cell lines, including A549, U-937, RKO, SW620, HCT-116, HT-29, and animal cell lines, including MARC-145, Vero, MDCK, CT26.CL25, sp2/0-Ag14, were used in this study. Mixed frozen tissue samples from the heart, lung, liver, spleen and kidney of the EEHV1A or EEHV4 cases were homogenized and used for cell inoculation. At 24, 48 and 72 hour-post infection (hpi), EEHV-inoculated cells were observed for the cytopathic effects (CPEs). Then, EEHV infection was determined by utilization of rabbit anti EEHV-gB polyclonal antibody via either immunoperoxidase monolayer assay (IPMA), indirect immunofluorescence assay (IFA),or immunohistochemistry (IHC). The results showed that after EEHV inoculation the immunolabeling positive signals were demonstrated only in U937 cells. Next, the cell supernatant fluid from infected U937 was used as an inoculum for further viral passaging. After, the viral replication in each passage of EEHV inoculated U937 cells were then validated in IHC using rabbit anti EEHV-DNA Polymerase polyclonal antibody. However, the EEHV DNA Polymerase was predominantly detected in early passages of U937 cells. In addition, the EEHV genomes were quantified using absolute quantitative polymerase chain reaction (qPCR). The genome of both EEHV1A and EEHV4 in U937 cell supernatant were gradually decreased at 1, 2, and 3 days post inoculation. This study demonstrated that, despite poorly adaptation in the U937 cells in higher passage, this cell line is promising to be used for isolation of EEHV1 and EEHV4 in vitro.

Abstract: การติดเชื้อไวรัส Elephant endotheliotropic herpesviruses (EEHV) ใน ลูกช้างเอเชีย (Elephas maximus) ทำให้เกิดภาวะ hemorrhagic disease ซึ่งสร้างความสูญเสียอย่างรุนแรง อย่างไรก็ตาม ในปัจจุบันยังไม่สามารถเพาะเลี้ยงหรือแยกเชื้อไวรัสชนิดนี้จากสัตว์ป่วยได้ การศึกษานี้จึงมีวัตถุประสงค์ เพื่อเพาะแยกเชื้อไวรัส EEHV) โดยใช้เลี้ยงเซลล์สายพันธุ์จากมนุษย์และสัตว์ชนิดต่างๆ โดยเซลล์มนุษย์ที่นำมาทดสอบได้แก่ A549, U937, RKO, SW620, HCT-116, และ HT-29 ส่วนเซลล์จากสัตว์ที่นำมาทดสอบได้แก่ MARC-145, Vero, MDCK, CT26.CL25, และ sp2/0-Ag1 4 โดยนำเซลล์ดังกล่าวมาเพาะเลี้ยงกับสารละลายไวรัสที่เตรียมจากการบดผสมอวัยวะแช่แข็งประกอบด้วยหัวใจ ปอด ตับ ม้าม ไต ของช้างที่เสียชีวิตจากการติดเชื้อ EEHV 1A หรือ EEHV 4 จากนั้นสังเกตุการเปลี่ยนแปลงของเซลล์ (Cytopathic effects; CPEs) ในเวลา 24, 48, และ 72 ชั่วโมงภายหลังการได้รับเชื้อไวรัส (hour post infection; hpi) และตรวจสอบการติดเชื้อไวรัส EEHV ด้วยวิธี immunoperoxidase monolayer assay (IPMA), indirect immunofluorescence assay (IFA), หรือ immunohistochemistry (IHC) โดยใช้ แอนติบอดี้ที่จำเพาะต่อโปรตีน EEHV-gB ผลการศึกษาพบว่า ภายหลังจากเซลล์ U937 ได้รับเชื้อไวรัส เซลล์ดังกล่าวแสดงผลเป็นบวกจากวิธี IHC ลำดับต่อมาอาหารเลี้ยงเซลล์ดังกล่วได้ถูกนำมาใช้เป็นหัวเชื้อสำหรับการสร้างไวรัส Passage ต่อไป และเซลล์ U937 ในแต่ละ Passage จะถูกนำมาตรวจสอบการติดเชื้อโดยแอนติบอดี้ที่จำเพาะต่อโปรตีน EEHV-DNA Polymerase อีกด้วย ผลจากศึกษาพบว่า เซลล์ U937 ใน Passage แรกให้ผลบวกต่อ EEHV DNA Polymerase ที่ โดดเด่น และพบน้อยลงใน Passage ต่อมา นอกจากนี้ปริมาณจีโนมของไวรัสทั้งสายพันธุ์ EEHV1A และ EEHV4 ค่อยๆ ลดลงตามลำดับในวันที่ 1 2 และ 3 หลังจากที่ทดสอบกับเชื้อไวรัส (days post inoculation: dpi) จากการศึกษานี้จึงสามารถสรุปผลได้ว่า เซลล์ U937 มีแนวโน้มเป็นเซลล์ที่ใช้แยกเชื้อไวรัส EEHV ได้อย่างไรก็ตามเซลล์ดังกล่าวจะสามารถติดเชื้อไวรัสใน passage แรก แต่ไม่สามารถปรับตัวเพื่อที่จะติดเชื้อไวรัสได้ในระยะยาว

Chiang Mai University. Library

Address: CHIANG MAI

Email: cmulibref@cmu.ac.th

Name: Kidsadagon Pringproa

Role: Advisor

Name: Chatchote Thitaram

Role: Advisor

Name: Phongsakorn Chuammitri

Role: Advisor

Created: 2020

Modified: 2024-01-08

Issued: 2024-01-08

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Veterinary Science

Grantor: Chiang Mai University

©copyrights Chiang Mai University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	611435905.pdf	4 MB	1	2024-08-05 21:18:14

ใช้เวลา

0.022016 วินาที