Effects of chemotherapeutic drug-curcumin nanoparticle conjugated with two peptides against flt3 protein on induction of leukemic stem cell death

ผลของอนุภาคนาโนของยาเคมีบำบัดและเคอร์คิวมินที่เชื่อมด้วยเปปไทด์สองชนิดต่อโปรตีน FLT3 ต่อการเหนี่ยวนำให้เกิดการตายของเซลล์ต้นกำเนิดมะเร็งเม็ดเลือดขาว

Name: Fah Chueahongthong

LCSH: Leukemia

LCSH: Leukemia -- Chemotherapy

LCSH: Curcumin

Abstract: Leukemic stem cells (LSCs) are an important cause of relapse in acute myeloblastic leukemia (AML) patient. Anthracyclines, such as doxorubicin (Dox) and idarubicin (Ida), are the standard chemotherapy for AML treatment, and found less effective to destroy LSC, and might generate adverse effects in high dose treatment. Curcumin (Cur) is the main natural polyphenolic compound found in the rhizome turmeric. It is known having anti-tumor, chemo-sensitizing, and chemoprotective activity. Therefore, to enhance efficacy and reduce toxicity of drug, the combination treatment of anthracyclines and Cur were evaluated on AML leukemic stem cells. The cytotoxicity of single and co-treatment of Dox, Ida, and Cur were investigated in AML leukemic stem cells (KG-1a and KG-1) and AML leukemic cells (EoL-1 and U937). The cytotoxic study of single drugs showed that Ida, Dox, and Cur exhibited higher toxicity in EoL-1 and U937 cells than KG-1a and KG-1 cells, resulting from the drug resistant properties of LSCs. Thus, the cytotoxic effects of co-treatments of Dox or Ida at concentration of IC10-IC80 values and each concentration of Cur at IC20, IC30, IC40, and IC50 were assessed. All conditions of Dox-Cur and Ida-Cur were observed to have a tendency to increase cytotoxicity in cell models according to the increase of Cur dose, compared to single treatment. However, only Dox-Cur showed additive effects in several conditions of co-treatment. Thus, this co-treatment of Dox-Cur was selected to study effects on FLT3 protein expression in FLT3 expressing cell, such as KG-1a, KG-1, and EoL-1 cells. The results showed all conditions of Dox-Cur could lower FLT3 protein expression level and lived cell number in all cells. Cur was expected as a main compound that affected FLT3 protein expression. In addition, co-treatment of Dox-Cur could induce G2/M cell cycle arrest and apoptosis in KG-1a and EoL-1 cells, that represent AML stem cells and leukemic cells, respectively, when compared to a single treatment and a control. Moreover, Dox-micelle (DM), Cur-micelle (CM), and Dox-Cur-micelle (DCM) were developed to improve drug uptake efficacy both compounds in leukemic cells. Besides, the drug-micelles were conjugated with FLT3 specific peptides (CKR and EVQ) to increase drugs deliver to leukemic cells through FLT3 receptor. DM, CM, and DCM were formulated by using a film-hydration technique together with a pH-induced self-assembly method. The optimal drug-to-polymer weight ratios for DM, CM, and DM formulations were 1:200, 1:40, and 1:40, respectively. The weight ratio of Dox and Cur in DCM was 1:9, which was derived from the lowest concentration of Dox and Cur that exhibited higher cytotoxicity than a single Dox treatment. For the examination of physicochemical properties, DM, CM, and DCM exhibited a particle size in the range of 20-25 nm with a narrow size distribution, neutral charge, and a high %EE (more than 80%), and -80°C was the effective micelle storage temperature. In addition, each micelle exhibited colloidal stability and could prolong drug release. Thus, these DM, CM, and DCM formulations were suitable for peptide conjugation. To construct a micelle conjugated with FLT3 peptides, P407 was converted to cargo azide (CA) and linked to FLT3 peptides to produce CA-CKR and CA-EVQ. CA-CKR and CA-EVQ were combined to provide micelle with two peptides (CA-CKR+CA-EVQ). Then, micelle was developed. DM, CM, and DCM coupled with peptide CKR (C), EVQ (E), and CKR+EVQ (C+E) exhibited a higher particle size and a slightly lower drug content compared to micelles without peptide, which may be attributable to the incorporation of the peptides. The assessment of cytotoxic effect revealed that DM-C+DM-E exhibited the highest cytotoxicity in KG-1a cells. DCM conjugated with or without peptides had no effects on KG-1a and EoL-1 cells due to an uncontrolled drug concentration ratio. Therefore, the cytotoxicity of co-treatment of several DM and CM was further investigated in KG-1a cells. The results showed that DM-C+CM-C showed the highest cytotoxicity. Moreover, DM-C+DM-E and DM-C+CM-C had the highest efficacy to induce apoptosis in KG-1a cells. The used of co-treatment of DM and CM could decrease concentration of Dox use in leukemic cell treatment. However, micelles conjugated with CKR or both CKR and EVQ were found no statistically significant difference in dose use for cytotoxic and apoptosis induction studies. These results suggested that the combination of micelle and FLT3-specific peptides could enhance Dox and Dox-Cur uptake by AML leukemic stem cells. The combination of the two peptides might enhance drug uptake activity and reduce the disadvantages of the individual peptides when stored for an extended period of time.

Abstract: มะเร็งเม็ดเลือดขาวต้นกำเนิด (Leukemic stem cell ; LSC) เป็นสาเหตุสำคัญของภาวะล้มเหลวของการรักษาในผู้ป่วยมะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิด acute myeloblastic leukemia (AML) ยาแอนทราซัยคลินส์ (Anthracyclines) เช่น ดอกโซรูบิซิน (Doxorubicin ; Dox) และไอดารูบิซิน (Idarubicin ; Ida) เป็นเคมีบำบัดมาตรฐานสำหรับรักษา AML และพบว่ามีประสิทธิภาพน้อยในการทำลาย LSC รวมถึงอาจส่งผลเสียในการรักษาด้วยยาในปริมาณสูง เคอร์คิวมิน (Curcumin ; Cur) เป็นสารประกอบโพลีฟีนอลหลักจากธรรมชาติหลักที่พบในเหง้าของขมิ้นชันซึ่งเป็นที่ทราบกันดีว่ามีฤทธิ์ต้านมะเร็ง ทำให้ไวต่อยาเคมีบำบัด และมีฤทธิ์ป้องกันพิษจากยาเคมีบำบัด ดังนั้นเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพและลดความเป็นพิษของยาการรักษาร่วมกันของยาแอนทราซัยคลินส์และ Cur ได้ศึกษาในมะเร็งเม็ดเลือดขาวต้นกำเนิดชนิด AML ความเป็นพิษต่อเซลล์ของการรักษาแบบยาเดี่ยวและการรักษาร่วมกันของยาเคมีบำบัด (Dox และ Ida) และ Cur ในเซลล์ต้นกำเนิดมะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิด AML (KG-1a และ KG-1) และเซลล์มะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิด AML (EoL-1 และ U937) การศึกษาความเป็นพิษต่อเซลล์ของยาเดี่ยวแสดงให้เห็นว่า Ida, Dox และ Cur แสดงความเป็นพิษต่อเซลล์ EoL-1 และ U937 มากกว่าเซลล์ KG-1a และ KG-1 ซึ่งเป็นผลมาจากคุณสมบัติการดื้อยาของ LSC ดังนั้นผลความเป็นพิษต่อเซลล์จากการบำบัดร่วมของ Dox หรือ Ida ที่ความเข้มข้นของ IC10-IC80 และแต่ละความเข้มข้นของ Cur ที่ IC20, IC30, IC40 และ IC50 ได้ทำการทดสอบและประเมิน ซึ่งทุกการทดสอบของ Dox-Cur และ Ida-Cur พบว่ามีแนวโน้มที่จะเพิ่มความเป็นพิษต่อเซลล์ตามการเพิ่มขึ้นของความเข้มข้นของ Cur เมื่อเทียบกับการรักษาด้วยยาเพียงอย่างเดียว อย่างไรก็ตามมีเฉพาะ Dox-Cur เท่านั้นที่แสดงผลเสริมฤทธิ์ในการทดสอบของการรักษาร่วม ดังนั้นการรักษาด้วย Dox-Cur ร่วมกันนี้จึงถูกเลือกเพื่อศึกษาผลกระทบต่อการแสดงออกของโปรตีน FLT3 ในเซลล์ที่มีการแสดงออกของโปรตีน FLT3 ได้แก่ เซลล์ KG-1a, KG-1 และ EoL-1 จากผลการศึกษาพบว่าทุกการทดสอบของ Dox-Cur สามารถลดระดับการแสดงออกของโปรตีน FLT3 และจำนวนเซลล์ที่มีชีวิตในเซลล์ทุกชนิด และคาดว่า Cur น่าจะเป็นสารหลักที่มีผลต่อการแสดงออกของโปรตีน FLT3 ซึ่งได้รับการยืนยันจากการทดสอบ Dox-Cur โดยการเพิ่มความเข้มข้นของ Cur โดยมีค่า Dox คงที่ พบว่าการแสดงออกของโปรตีน FLT3 ลดลงตามความเข้มข้นของ Cur ที่เพิ่มขึ้น นอกจากนี้การรักษาร่วมกันของ Dox และ Cur สามารถกระตุ้นให้เกิดการชะลอวัฏจักรของเซลล์ (cell cycle arrest) ที่ระยะ G2/M และเหนี่ยวนำให้เกิดการตายแบบอะพอพโตซิส (apoptosis) ในเซลล์ KG-1a และ EoL-1 ซึ่งเป็นตัวแทนของเซลล์ต้นกำเนิดมะเร็งเม็ดเลือดขาวและเซลล์มะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิด AML เปรียบเทียบกับการรักษาด้วย Dox และชุดควบคุม นอกจากนี้ทั้ง Dox และ Cur ยังถูกนำมาพัฒนาในรูปแบบของอนุภาคนาโน Dox-micelle (DM), Cur-micelle (CM) และ Dox-Cur-micelle (DCM) เพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพการนำเข้ายาของสารทั้งสองชนิดในเซลล์มะเร็งเม็ดเลือดขาว ยิ่งไปกว่านั้น drug-micelle จะถูกติดด้วยเปปไทด์ที่มีความจำเพาะต่อโปรตีน FLT3 (CKR และ EVQ) เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการนำส่งยาเข้าสู่เซลล์มะเร็งเม็ดเลือดขาวผ่านตัวรับ FLT3 ซึ่ง DM, CM และ DCM ถูกสร้างโดยใช้วิธี film-hydration ร่วมกับ pH-induced self-assembly โดยมีอัตราส่วนน้ำหนักยาต่อพอลิเมอร์ที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการสร้าง DM, CM และ DCM เท่ากับ 1:200, 1:40 และ 1:40 ตามลำดับ และอัตราส่วนน้ำหนัก Dox และ Cur ใน DCM เท่ากับ 1:9 ซึ่งมาจากความเข้มข้นต่ำสุดของ Dox และ Cur ที่มีความเป็นพิษมากกว่าการรักษาด้วย Dox เพียงอย่างเดียว สำหรับการทดสอบคุณสมบัติทางเคมีกายภาพของ DM, CM และ DCM พบว่าขนาดอนุภาคอยู่ในช่วง 20-25 nm โดยมีการกระจายของขนาดต่ำ มีประจุเป็นกลาง มี %EE สูง (มากกว่า 80%) และที่ -80°C เป็นอุณหภูมิที่มีประสิทธิภาพในการรักษาไมเซลล์ให้คงตัว จากผลการทดลองยังพบว่าไมเซลล์แต่ละชนิดมีความคงตัวในสภาวะคอลลอยด์และสามารถยืดเวลาการปลดปล่อยยาได้ดี ดังนั้นตำหรับการสร้าง DM, CM และ DCM เหล่านี้จึงมีความเหมาะสมในการสร้างไมเซลล์ที่เชื่อมต่อด้วยเปปไทด์ FLT3 โดย P407 จะถูกเปลี่ยนเป็น cargo azide (CA) และเชื่อมต่อกับเปปไทด์ FLT3 เพื่อสร้าง CA-CKR และ CA-EVQ จากนั้นจึงถูกพัฒนาเป็นไมเซลล์ (DM, CM และ DCM) ที่เชื่อมต่อด้วยเปปไทด์ CKR (C) หรือ EVQ (E) นอกจากนี้ CA-CKR และ CA-EVQ จะถูกนำมารวมกันเพื่อสร้างไมเซลล์ที่มีเปปไทด์ทั้ง 2 ชนิด (CA-CKR+CA-EVQ ; C+E) อีกด้วย เมื่อวัดขนาดอนุภาคพบว่ามีขนาดใหญ่กว่าและมีปริมาณยาที่ลดลงเล็กน้อยเมื่อเปรียบเทียบกับไมเซลล์ที่ไม่มีเปปไทด์ ซึ่งอาจเป็นผลจากการเชื่อมต่อโพลิเมอร์ด้วยเปปไทด์ การศึกษาผลความเป็นพิษต่อเซลล์พบว่า DM-C+DM-E และ CM-C+CM-E มีความเป็นพิษต่อเซลล์มากที่สุดในเซลล์ KG-1a เปรียบเทียบกับ Dox และ Cur ที่ความเข้มข้นเดียวกัน ในขณะที่ DCM ที่มีและไม่มีการเชื่อมต่อด้วยเปปไทด์ FLT3 ไม่มีผลต่อทั้งเซลล์ KG-1a และ EoL-1 เนื่องจากอัตราส่วนของความเข้มข้นของยาที่ไม่สามารถควบคุมได้ ดังนั้นความเป็นพิษต่อเซลล์ของการรักษาร่วมกันของ DM และ CM ในรูปแบบต่าง ๆ จึงถูกทดสอบในเซลล์ KG-1a ผลการทดลองพบว่า DM-C+CM-C มีความเป็นพิษสูงสุด นอกจากนี้ DM-C+DM-E และ DM-C+CM-C ยังมีประสิทธิภาพสูงสุดในการเหนี่ยวนำให้เกิดการตายแบบอะพอพโตซิสในเซลล์ KG-1a การใช้การรักษาร่วมกันของ DM และ CM สามารถลดความเข้มข้นของ Dox ที่ใช้ในการทดสอบเซลล์ อย่างไรก็ตามไมเซลล์ที่ติดด้วย CKR หรือทั้ง CKR และ EVQ พบว่ามีผลการทดลองที่ไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติในระดับยาสำหรับการศึกษาความเป็นพิษต่อเซลล์และการเหนี่ยวนำให้เกิดการตายแบบอะพอพโตซิส ผลการทดสอบเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการรวมกันของไมเซลล์และเปปไทด์ที่จำเพาะต่อ FLT3 สามารถเหนี่ยวนำให้มีการนำเข้า Dox และ Dox-Cur ในเซลล์ต้นกำเนิดมะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิด AML ซึ่งการใช้สองเปปไทด์ร่วมกันอาจเพิ่มการเหนี่ยวนำให้เกิดการนำเข้ายาและลดข้อเสียของเปปไทด์แต่ละตัวเมื่อเก็บไว้เป็นระยะเวลานานก่อนนำมาใช้

Chiang Mai University. Library

Address: CHIANG MAI

Email: cmulibref@cmu.ac.th

Name: Songyot Anuchapreeda

Role: Advisor

Name: Siriporn Okonogi

Role: Advisor

Name: Chadarat Ampasavate

Role: Advisor

Name: Sawitree Chiampanichayakul

Role: Advisor

Name: Singkome Tima

Role: Advisor

Created: 2022

Modified: 2023-07-22

Issued: 2023-07-22

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Biomedical Sciences

Grantor: Chiang Mai University

©copyrights Chiang Mai University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	591151009.pdf	5.07 MB

ใช้เวลา

0.040958 วินาที