การคัดกรองและลักษณะสมบัติของไลเพสจากแบคทีเรียชอบเค็มปานกลาง

Screening and characterization of lipase from moderately halophilic bacteria

Name: ศุภฤกษ์ เยี่ยมสมบัติ

keyword: แบคทีเรียชอบเค็ม

; ไลเปส

Abstract: ในการคัดแยกแบคทีเรียชอบเค็มปานกลางจำนวนทั้งหมด 77 สายพันธุ์ จากตัวอย่างกะปิทั้งหมด 8 ตัวอย่าง ที่เก็บจากตลาดสดมหาชัย จังหวัดสมุทรสาคร จากการคัดกรองสร้างเอนไซม์ไลเพสบนอาหารแข็งที่มีสับเสตรทเป็น Tween 20, 40, 60, 80 และ tributyrin พบว่ามีแบคทีเรียจำนวน 61 สายพันธุ์สามารถผลิตเอนไซม์ไลเพสได้ และมีแบคทีเรียจำนวน 23 สายพันธุ์ สามารถผลิตเอนไซม์ไลเพสได้เมื่อนำมาคัดกรองการผลิตเอนไซม์ไลเพสในอาหารเหลวที่มีสับเสตรทเป็น p-Nitrophenyl butyrate (p-NPB) จึงได้คัดเลือกตัวแทนแบคทีเรียชอบเค็มปานกลางที่มีแอกทิวิตีการผลิตเอนไซม์ไลเพสจำนวน 12 ไอโซเลท และไอโซเลทที่ไม่มีแอกทิวิตีจำนวน 26 ไอโซเลท ในอาหารเหลวมาศึกษาลักษณะทางฟีโนไทป์และวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน 16S rRNA พบว่าสามารถจัดกลุ่มแบคทีเรียตัวแทนที่ย้อมติดสีแกรมบวกทั้งหมด 38 ไอโซเลทได้เป็นทั้งหมด 9 สกุล ได้แก่ สกุล Oceanobaillus (2 สายพันธุ์), Virgibacillus (2 สายพันธุ์), Halobacillus (2 สายพันธุ์), Thalassobacillus (2 สายพันธุ์), Bacillus (5 สายพันธุ์), Staphylococcus (9 สายพันธุ์), Salinicoccus (12 สายพันธุ์), Nesterenkonia (2 สายพันธุ์) และ Allobacillus (2 สายพันธุ์) จากการศึกษาลักษณะอนุกรมวิธานแบบโพลีฟาสิกของ Allobacillus sp. 2 สายพันธุ์ ได้แก่ SKP4-8 และ SKP8-2 จัดเป็นแบคทีเรียสปีชีส์ใหม่ ซึ่งมีผลการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์บริเวณยีน 16S rRNA ของสายพันธุ์ SKP4-8 และ SKP8-2 ใกล้เคียงกับสายพันธุ์ Allobacillus halotolerans B3AT เป็น 99.14 และ 98.80 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ และทั้ง 2 สายพันธุ์ มีความคล้ายคลึงของ DNA เป็น 46.6 ถึง 56.8 เปอร์เซ็นต์ เมื่อเทียบกับ Allobacillus halotolerans B3AT ตามลำดับ จึงสามารถเสนอทั้ง 2 สายพันธุ์เป็นแบคทีเรียชอบเค็มปานกลางสปีชีส์ใหม่ชื่อว่า Allobacillus saliphilus จากการศึกษาการผลิตเอนไซม์ไลเพสของสายพันธุ์ SKP5-4 ซึ่งพิสูจน์เอกลักษณ์ได้เป็น Virgibacillus halodenitrificans และพบว่าสามารถสร้างเอนไซม์ไลเพสได้สูงสุดในระยะ stationary phase เมื่อเลี้ยงในอาหารดัดแปลงสูตร JCM no. 377 ที่ความเข้มข้นเกลือ 5 เปอร์เซ็นต์ พีเอช 8.0 อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 ชั่วโมง แล้วทำเอนไซม์ให้บริสุทธิ์ด้วยเทคนิค acetone precipitation, anion exchange chromatography พบว่าไลเพสที่ได้มีความบริสุทธิ์ขึ้นถึง 11.6 เท่า มีขนาดมวลโมเลกุล 50, 43, 30 และ 12 กิโลดาลตันและลักษณะสมบัติของเอนไซม์ไลเพสสามารถทำงานได้ดีที่สุดในสภาวะที่พีเอช 7.0 ความเข้มข้นเกลือโซเดียมคลอไรด์ 2 เปอร์เซ็นต์ และอุณหภูมิ 40 องศาเซลเซียส นอกจากนี้เอนไซม์ยังมีความจำเพาะเจาะจงต่อสับสเตรท p-nitrophenyl butyrate (C4:0)

Abstract: Seventy-seven of lipase-producing halophilic bacteria from fermented shrimp pastes collected from Mahachai market, Samut Sakhon province were isolated. The strians were screened for their lipolytic activity using agar plates supplemented with Tween 20, 40, 60, 80 or tributyrin as substrates. Sixty-one strians showed lipase activity on agar plates while twenty-three strians showed lipase activity in broth when determined using p-Nitrophenyl butyrate (p-NPB) as substrate. Twelve strians that have activity and twenty-six strians that have no activity were selected as representatives for the identification. On the basis of phenotypic characteristics and 16S rRNA gene sequences, thirty-two strians were belonged to 9 genera including Oceanobacillus (2 strians), Virgibacillus (2 strians), Halobacillus (2 strians), Thalassobacillus (2 strians), Bacillus (5 strians), Staphylococcus (9 strians), Salinicoccus (12 strians), Nesterenkonia (2 strians) and Allobacillus (2 strians). The 16S rRNA gene sequences analysis indicated that strains SKP4-8 and SKP8-2 were closely related to Allobacillus halotolerans B3AT 99.14 and 98.80%, respectively, and they exhibited 46.6 and 56.8 % DNA-DNA relatedness, respectively with Allobacillus halotolerans B3AT. Based on polyphasic taxonomic study, Allobacillus sp., strains SKP4-8 and SKP8-2 were belonged to the novel species. They will be proposed as a new moderately halophilic species, namely Allobacillus saliphilus. Strain SKP5-4 identified as Virgibacillus halodenitrificans was selected for lipase production and it could produce the maximum lipase at stationary phase in modified JCM no. 377 at 5% concentration, pH 8.0, 37 °C and 30 hours. The lipase of SKP5-4 was purified by cold acetone precipitation and anion exchange chromatography with 11.6-fold purification. The purified lipase was the protein with molecular mass of about 50, 43, 30 and 12 kDa.The enzyme had a maximal activity in the present pH 7.0, 2% of NaCl and at 40 °C. The enzyme exhibited specific activity especially with p-nitrophenyl butyrate (C4:0).

จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. สำนักงานวิทยทรัพยากร

Address: กรุงเทพมหานคร

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: อัญชริดา อัครจรัลญา

Role: ที่ปรึกษา

Name: สมบูรณ์ ธนาศุภวัฒน์

Role: ที่ปรึกษา

Created: 2560

Modified: 2020-07-17

Issued: 2563-07-17

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

URL: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/61026

tha

DegreeName: วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต

Level: ปริญญาโท

Descipline: เทคโนโลยีชีวภาพ

Grantor: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

©copyrights จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	5872065823.pdf	4.39 MB	3	2024-07-17 14:41:33

ใช้เวลา

0.037333 วินาที