โคลนิงและการแสดงออกของไซแลเนสยีนจาก Streptomyces sp.42-9 ใน Streptomyces sp.190-1

Cloning and exprression of xylanase gene from streptomyces sp.42-9 in streptomyces sp.190-1

Name: อรินทิพย์ ธรรมชัยพิเนต

ThaSH: โคลนิง

ThaSH: ไซแลนเนส

ThaSH: สเตรปโตมัยซิส

ThaSH: พลาสมิดพีไอเจ 699

ThaSH: แบคทีเรียลทรานสฟอร์เมชัน

ThaSH: โครโมโซมอลดีเอนเอ

ThaSH: โปรโตพลาสต์

ThaSH: อาหารเลี้ยงเชื้อ

Abstract: ได้ทำการโคลนไซแลเนสยีนจาก Streptomyces sp.42-9 โดยใช้ชิ้นส่วนขนาด 5 กิโลเบสของพลาสมิด pIJ699 และพลาสมิด pIJ702 เป็นดีเอนเอพาหะผ่าน S. lividans TK64 ซึ่งเป็นสายพันธุ์มาตรฐาน เข้าสู่ Streptomyces sp.190-1 ทั้งนี้เพราะ S. lividans TK64 มีประสิทธิภาพในการทรานสฟอร์มพลาสมิดพาหะสูงกว่า Streptomyces sp.190-1 ประมาณ 100 เท่า ผลการโคลนโดยใช้ชิ้นส่วนของพลาสมิด pIJ699 เป็นดีเอนเอพาหะ พบว่าได้ 3 โคลนที่มีไซแลเนสแอคติวิตี ซึ่งได้รีคอมบิแนนท์พลาสมิด คือ pPT6C, pPT6E และ pPT6G เมื่อนำเซลล์เจ้าบ้านที่มีพลาสมิดทั้ง 3 นี้ มาเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีไซแลนเป็นองค์ประกอบ พบว่าเมื่อใช้ S. lividans TK64 เป็นเซลล์เจ้าบ้าน จะได้ไซแลเนสแอคติวิตีเท่ากับ 5.19, 4.85 และ 4.28 หน่วย/มล. ตามลำดับ และเมื่อใช้ Streptomyces sp.190-1 เป็นเซลล์เจ้าบ้าน จะได้ไซแลเนสแอคติวิตีเท่ากับ 2.93, 2.82 และ 2.73 หน่วย/มล. ตามลำดับ จากการหาขนาดของชิ้นส่วนดีเอนเอที่มีไซแลเนสยีนซึ่งใส่เข้าไป (inserted DNA) ในดีเอนเอพาหะในพลาสมิด pPT6C, pPT6E และ pPT6G โดยการทำอิเลคโตรโฟรีซีสบนอะกาโรสเจล พบว่ามีขนาด 4.8, 14.2 และ 9.4 กิโลเบส ตามลำดับ เมื่อใช้ pIJ702 เป็นดีเอนเอพาหะ พบว่าได้ 5 โคลนที่มีไซแลเนสแอคติวิตี ซึ่งได้รีคอมบิแนนท์พลาสมิดคือ pPT7-1, pPT7-2, pPT7-3, pPT7-4 และ pPT7-5 เมื่อนำเซลล์เจ้าบ้านที่มีพลาสมิดทั้ง 5 นี้ มาเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีไซแลนเป็นองค์ประกอบ พบว่าเมื่อใช้ S. lividans TK64 เป็นเซลล์เจ้าบ้าน จะได้ไซแลเนสแอคติวิตีเท่ากับ 0.79, 0.73, 0.35, 0.32 และ 0.32 หน่วย/มล. ตามลำดับ และเมื่อใช้ Streptomyces sp.190-1 เป็นเซลล์เจ้าบ้าน จะได้ไซแลเนสแอคติวิตีเท่ากับ 3.22, 3.13, 2.73, 1.92 และ 2.32 หน่วย/มล. ตามลำดับ จากการหาขนาดของชิ้นส่วนดีเอนเอที่มีไซแลเนสยีนในพลาสมิด pPT7-1, pPT7-2, pPT7-3, pPT7-4 และ pPT7-5 โดยการทำอิเลคโตรโฟรีซีสบนอะกาโรสเจล พบว่ามีขนาด 0.5, 4.4, 0.5, 6.4 และ 4.4 กิโลเบส ตามลำดับ ผลการโคลนไซแลเนสยีนจาก Streptomyces sp.42-9 ด้วยพลาสมิดพาหะ pIJ699 และ pIJ702 เข้าสู่ Streptomyces sp.190-1 พบว่าสามารถเพิ่มประสิทธิภาพการสร้างไซแลเนสของ Streptomyces sp.190-1 ขึ้นจากเดิม 7-12 นอกจากนั้น Streptomyces sp.190-1 ที่ได้รับพลาสมิดซึ่งมีไซแลเนสยีนยังคงสามารถผลิตกลูโคสไอโซเมอเรสได้ 800-1000 หน่วย/กรัมน้ำหนักเซลล์แห้ง

Abstract: Xylanase gene had been cloned from Streptomyces sp.42-9 through S. lividans TK64, a standard strain, in Streptomyces sp.190-1 by using a 5-Kb fragment of plasmid pIJ699 and plasmid pIJ702 as cloning vectors. S. lividans TK64 was used as an intermediate host cell for this gene cloning because it had approximately 100 folds higher transformation efficiency than that of Streptomyces sp.190-1. Three clones containing xylanase activity were obtained when a 5-Kb fragment from pIJ699 was used as a cloning vector. Recombinant plasmids pPT6C, pPT6E and pPT6G were isolated from these clones. Cultivation of S. lividans TK64 harboring pPT6C, pPT6E and pPT6G in a medium containing xylan yielded 5.19, 4.85 and 4.28 units of xylanase/ml of culture broth, respectively, while using Streptomyces sp.190-1 as a host yielded 2.93, 2.82 and 2.73 units of xylanase/ml, respectively. Size of the inserts in pPT6C, pPT6E and pPT6G were determined by agarose gel electrophoresis to be 4.8, 14.2 and 9.4 Kb, respectively. When pIJ702 was used as a cloning vector, five clones containing xylanase activity were obtained yielding five recombinant plasmids namely, pPT7-1, pPT7-2, pPT7-3, pPT7-4 and pPT7-5. Xylanase activity of S. lividans TK64 harboring pPT7-1, pPT7-2, pPT7-3, pPT7-4 and pPT7-5 when cultivated in xylan containing medium were 0.79, 0.73, 0.35, 0.32 unit/ml, respectively, but when Streptomyces sp.190-1 was used as a host for the corresponding plasmids 3.22, 3.13, 2.73, 1.92 and 2.32 units of xylanase/ml were produced, respectively. Size of the inserts in pPT7-1, pPT7-2, pPT7-3, pPT7-4 and pPT7-5 were determined to be 0.5, 4.4, 0.5, 6.4 and 4.4 Kb, respectively. Cloning of xylanase gene from Streptomyces sp.42-9 by using pIJ699 and pIJ702 as cloning vectors in Streptomyces sp.190-1 could increase xylanase producing ability of Streptomyces sp.190-1 to about 7-12 folds. Furthermore, Streptomyces sp.190-1 harboring plasmids containing xylanase gene were still able to produce about 800-1000 units of glucose isomerase per gram of dried cells.

จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. สำนักงานวิทยทรัพยากร

Address: กรุงเทพมหานคร

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: ไพเราะ ปิ่นพานิชการ

Role: ที่ปรึกษา

Created: 2533

Modified: 2561-05-20

Issued: 2561-05-20

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

URL: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/31477

tha

DegreeName: วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต

Level: ปริญญาโท

Descipline: จุลชีววิทยา

Grantor: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

©copyrights จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	Arinthip_th_front.pdf	6.37 MB
2	Arinthip_th_ch1.pdf	6.04 MB
3	Arinthip_th_ch2.pdf	7.45 MB
4	Arinthip_th_ch3.pdf	14.3 MB	1	2021-06-19 18:06:53
5	Arinthip_th_ch4.pdf	5.21 MB
6	Arinthip_th_back.pdf	9.08 MB

ใช้เวลา

0.041122 วินาที