Determination of lectin in root and leaf of rice (Oryza sativa L.) by enzyme-linked immunosorbent assay

การหาปริมาณเลกตินในรากและใบของข้าว (Oryza sativa L.) โดยวิธีเอนไซม์ลิงค์อิมมูโนซอร์เบนต์แอสเสย

Name: Srimake Chaopongpang

LCSH: enzyme-linked immunosorbent assay

LCSH: lectin

Abstract: Lectin was purified from embryos of rice cv RD 7 and RD 25 to the purity of 1,637 and 1 ,632 fold of crude extracts respectively. Production of antibody against lectin was achieved yielding serum titer 16 for cv RD 7, and it was able to cross-react with lectin RD 25 completely by technique of agar gel diffusion. The antibody showed cross-reaction with lectin from 30 cultivars (Oryza sativa L.) 2 wild rice species and WGA (Wheat Germ Agglutinin). The antibody against lectin RD 7 was used in combination with FITC-goat antirabbit immunoglobulin to localize the lectin in root and leaf of rice seedlings on day 4 and day 7 grown under dark condition. Lectin was located on the root cap, root hair tip, and also on epidermal cells. In the leaf, lectin was observed on hydathode and stoma. The indirect ELISA method was developed using lectin RD 7 antibody and goat antirabbit immunoglobulin conjugated with alkaline phosphatase which showed the high sensitivity of 10 ng lectin/ml, and assay range of 10-60 ng/ml , its accuracy was high(92-98 % recovery), with % CV of intra-assay 2-7%and interassay of 2-11%. Lectin can be quantitated in embryo of 28 rice cultivars by ELISA exhibiting the average value of 3218± 1350 nanogram/50 embryos. The quantitative determination of root and leaf lectin in 4-7 day old seedling required modification of ELISA method by albumin precoating which gave the same sensitivity as the first method, but wide assay range of 10-100 ng/ml. The per cent CV of intra-assay and interassay was 4-11% and 2-13% respectively. It was found by this method that seedlings of rice cv RD 7 grown under dark and light condition differed in leaf lectin content. Maximum lectin content in leaf and root were significantly observed on day 4. Comparison of lectin contents in seedlings among 8 rice cultivars, showed the highest value in NMS 4 both in leaf and root (42304 ± 1135 and 92±20 ng/100 plants), and the lowest in KDML 105 (598±151 and 5 ng/100 plants) . Lectin in seedling was significantly decreased both in the leaf and root when grown under 2 and 20 mMNH4Cl. Study on the cross-reaction among 32 rice varieties to antibody against lectin RD 7 , indicated that some varieties contained lectin identical to RD 7, and the others are partially identical, however some varieties contained lectin more than one form . Lectin from all varieties of rice tested and wheat (WGA) shared a common antigenic determinant to lectin RD 7. The quantity of' lectin was comparatively high in embryo, and gradually decreased in developmental seedling. In flowering stage lectin was merely detected in adventitious root tip

Abstract: ทำการสกัดเลกตินจากเอมบริโอของข้าวพันธุ์ กข.7 และกข.25 ได้ความบริสุทธิ์ถึง 1,637 และ 1,362 เท่าตามลำดับ ได้ผลิตแอนติบอดีต่อเลกตินของข้าวพันธุ์ กข.7 ซึ่งมีค่าไตเตอร์เท่ากับ 16 จากการทำ a gar gel diffusion พบว่าแอนติบอดีต่อเลกตินของข้าวพันธุ์ กข.7 สามารถทำปฏิกิริยาข้ามกับเลกตินของข้าว(Oryza sativa) พันธุอื่นๆได้ 30 พันธุ์ ข้าวป่าอีก 2 ชนิดรวมทั้ง เลกตินจากข้าวสาลี(Wheat Germ Agglutinin) และทำปฏิกิริยาข้ามกับ เลกตินของข้าวพันธุ์ กข.25 ได้อย่างสมบูรณ์ เมื่อนำแอนติบอดีต่อเลกตินข้าวพันธุ์ กข.7 นี้รวมกับแอนติบอดีแพะต่ออิมมูโนกลอบบูลิน กระต่ายที่ติดฉลากด้วยสารเรืองแสงฟลูอฺอเรสซีนไอโสไธโอไซยาเนต เพื่อหาตำแหน่งของเลกตินในราก และใบของกล้าข้าวอายุ 4 และ 7 วัน ที่เจริญในที่มืด และมีแสงสว่าง พบเลกตินที่หมวกราก ปลายรากขนอ่อนและตามผิวของเซลล์บุผิวชั้นนอกของราก ส่วนที่ใบพบเลกตินเฉพาะที่รูคายนํ้า (hydathode)และปากใบเท่านั้น ได้พัฒนาวิธี EL1SA ทางอ้อมขึ้นเพื่อหาปริมาณเลกติน โดยใช้แอนติบอดีต่อเลกตินข้าวพันธุ์ กข. 7 และแอนติบอดีแพะต่ออิมมูโนกลอบบูลินกระต่ายที่ติดฉลากด้วย เอนไซม์อัลคาไลน์ฟอสฟาเทส วิธีนี้ให้ความไวสูงถึง 10 นาโนกรัมเลกตินต่อมิลลิลิตร ช่วงที่วัดได้ 10-60 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร ให้ความถูกต้องสูงคือมีเปอร์เซ็นต์รีคอบเวอรี 92-98% และ%CV ภายในการทดลองเดียวกัน 2-7 % ระหว่างทดลอง 2-11 % ผลการหาปริมาณเลกตินในเอมบริโอของข้าว 28 พันธุ์ โดยวิธี ELISA ให้ค่าเฉลี่ยของเลกติน 3218 ±1350 นาโนกรัม/50 เอมบริโอ การหาปริมาณเลกตินในรากและใบของกล้าข้าวอายุ 4-7 วันนั้น ได้พัฒนาวิธี ELISA ที่ดัดแปลงโดยที่เพลทต้องผ่านการเคลือบด้วยโอวัลบูมินก่อนซึ่งมีความไวเท่าวิธีแรกแต่ช่วงที่วัดได้ 10-100 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร และ % CV ในการทดลองเดียวกัน 4-11 % ระหว่างการทด ลอง 2-13 % ปริมาณเลกตินในเอมบริโอข้าวที่หาโดยวิธีดัดแปลงนี้ได้ค่าใกล้เคียงกับวิธีเดิม คือมีความแตก ต่างกัน 2-13 % และเมื่อใช้วิธีดัดแปลงนี้หาปริมาณเลกตินในใบของกล้าข้าวพันธุ์ กข.7พบว่ามีความแตกต่างกันระหว่างกล้าข้าวที่เจริญในที่มืดและที่มีแสงสว่าง ปริมาณของเลกตินสูงสุดในรากและใบสังเกตได้ชัด ในข้าวอายุ 4 วัน การเปรียบเทียบเลกตินในกล้าข้าว 8 พันธุ์ พบว่าข้าวพันธุ์นางมล เอส 4 ให้ค่าเลกตินสูงสุดทั้งในใบและราก (4230±1135 และ 92±20 นาโนกรัมต่อ 100 ต้นตามลำดับ) และค่าต่ำสุดพบในใบและรากข้าวพันธุ์ขาวดอกมะลิ 105 (589±151 และ5 นาโนกรัมต่อ 100 ต้น ตามลำดับ) ปริมาณเลกตินในกล้าข้าวลดลงอย่างมีนัยสำคัญทั้งในใบและราก เมื่อเติมแอมโมเนียมคลอไรด์ 2 และ 20 มิลลิโมลาร์ ลงในน้ำที่ใช้เลี้ยงกล้าข้าว จากการศึกษาปฏิกิริยาข้ามของข้าว 32 สายพันธุ์กับแอนติบอดีต่อเลกตินข้าวพันธุ์ กข.7 พบว่า บางพันธุ์มีลักษณะของเลกตินเหมือนกับพันธุ์ กข.7 และบางพันธุ์มีความคล้ายคลึงกับพันธุ์ กข.7 นอกจากนี้ บางพันธุ์ยังมีเลกตินมากกว่าหนึ่งชนิด เลกตินจากข้าวทุกพันธุ์ที่ทดสอบรวมทั้งข้าวสาลี มีปฏิกิริยาข้ามกับเลกตินข้าวพันธุ์ กข.7 ปริมาณเลกตินพบสูงสุดในเอมบริโอ และลดลงตามลำดับเมื่อมีการงอกของต้นกล้าข้าว และเลกตินในรากวิสามัญของข้าวในระยะออกรวงสามารถตรวจพบได้เฉพาะที่ปลายราก

Chulalongkorn University. Office of Academic Resources

Address: BANGKOK

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: Jariya Boonjawat

Role: advisor

Name: Preeda Chaisiri

Role: advisor

Created: 1989

Modified: 2561-04-21

Issued: 2018-04-12

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

URL: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/28475

ISBN: 9745765368

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Biochemistry

Grantor: Chulalongkorn University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	Srimake_ch_front.pdf	11.32 MB
2	Srimake_ch_ch1.pdf	15.97 MB
3	Srimake_ch_ch2.pdf	17.7 MB
4	Srimake_ch_ch3.pdf	36.9 MB
5	Srimake_ch_ch4.pdf	10.5 MB
6	Srimake_ch_back.pdf	17.2 MB

ใช้เวลา

0.052518 วินาที