การผลิตและการทำให้บริสุทธิ์บางส่วนของสารปฏิชีวนะจาก Bacillus sp. SR-1

Production and partial purification of antibiotic from Bacillus sp. SR-1

Name: รุ่งอรุณ วาดิถี

ThaSH: ปฏิชีวนะ -- การวิเคราะห์

ThaSH: แบคทีเรียแกรมบวก

ThaSH: สารต้านแบคทีเรีย

ThaSH: โครมาโตกราฟี

ThaSH: บาซิลัสไลเคนิฟอร์มิส

Abstract: ได้คัดแยกแบคทีเรียสายพันธุ์ SR-1 จากตัวอย่างหนังสัตว์ที่มีการติดเชื้อ และสามารถจัดจำแนกได้ใกล้เคียงกับ Bacillus licheniformis สายพันธุ์ SR-1 สามารถสร้างสารยับยั้งการเจริญของจุลินทรีย์ ได้ทั้งแบคทีเรีย รา และยีสต์ ได้นำสายพันธุ์ SR-1 มาหาสภาวะที่เหมาะสมสำหรับการผลิตสารปฏิชีวนะในระดับขวดเขย่า โดยการปรับปรุงสูตรอาหารและภาวะในการเลี้ยง พบว่าสายพันธุ์ SR-1 ผลิตสารปฏิชีวนะได้สูงสุดในอาหารสูตรปรับปรุง R-1 ซึ่งมีองค์ประกอบเป็น แบคโตเปปโตน 0.5% สารสกัดจากเนื้อ 0.3% มอลโตส 1.0% สารสกัดจากยีสต์ 0.25% และแมงกานีสคลอไรด์ ความเข้มข้น 0.5 10-5 โมลาร์ โดยมีพีเอชเริ่มต้นของอาหารเป็น 7.0 เลี้ยงที่อุณหภูมิ 35°ช. บนแคร่เขย่าความเร็ว 200 รอบต่อนาที ซึ่งจะให้ค่าของสารปฏิชีวนะ 24.36 หน่วย/มก. น้ำหนักเซลแห้งในชั่วโมงที่ 60 ของการเลี้ยงเชื้อ สารปฏิชีวนะที่สร้างขึ้นจากสายพันธุ์ SR-1 เป็นผลิตภัณฑ์ที่เกิดขึ้นภายในเซล ได้ทำการสกัดแยกสารปฏิชีวนะออกจากเซลโดยการแช่แข็งร่วมกับการใช้เอ็นไซม์ไลโซไซม์ และสามารถทำสารปฏิชีวนะให้บริสุทธิ์บางส่วนโดยการไดอะไลซ์ในกลีเซอรอล ผ่านคอลัมน์เซฟ-แพก ซี18 2ครั้ง และตามด้วยคอลัมน์เซฟาเด็กซ์จี-25 ตามกระบวนการดังกล่าวทำให้สารปฏิชีวนะมีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 16 เท่า สารปฏิชีวนะกึ่งบริสุทธิ์ที่ได้สามารถยับยั้งแบคทีเรียแกรมบวก Bacillus cereus ATCC 11778 Bacillus subtilis ATCC 6633 Bacillus megaterium ATCC 14581 Staphylococcus aureus ATCC 25923 และรา Gliocladium sp. Paecilomyces variotii ได้ตรวจสอบความบริสุทธิ์ของสารปฏิชีวนะที่ได้ โดยการทำโครมาโตกราฟีแบบสมรรถนะสูง ซึ่งปรากฏยอดพีคเด่น 1 พีคที่ Retention time เป็น 2.15 นาที เมื่อได้นำมาตรวจสอบหาน้ำหนักโมเลกุลโดยการทำเจลอิเลคโตรโฟริซิส ได้ค่าน้ำหนักโมเลกุลของสารปฏิชีวนะที่ได้จากสายพันธุ์ SR-1 ประมาณ 9700 ดาลตัน และได้ตรวจสอบโครงสร้างเบื้องต้น โดยการทำอินฟาเรดสเปกตรัมจะให้แถบเด่นในช่วงการดึงของโมเลกุลเป็น 3450 1650 และ 1450 ชม. -¹ ตามลำดับ ซึ่งแสดงให้เห็นว่าสารปฏิชีวนะที่ได้จากสายพันธุ์ SR-1 เป็นสารปฏิชีวนะกลุ่มเพปไทด์ สารปฏิชีวนะที่ได้จากสายพันธุ์ SR-1 มีความเสถียรสูงสุดในช่วงพีเอช 7.0-7.5 และที่อุณหภูมิ 30°ช. ไม่สูญเสียกิจกรรมต่อเบต้าแลกแตมเมส เบต้ากลูโคซีเตส ไลโซไซม์ ปาเปน โปรติเนสเค สูญเสียกิจกรรมบางส่วนต่อเปปซิน และสูญเสียกิจกรรมทั้งหมดต่อทริปซิน

Abstract: The bacterial strain; SR-1, was isolated from infected leather, and identified as Bacillus licheniformis. This strain was found the capability to produce an antifungal and antibacterial antibiotics. The cultivated conditions for antibiotic production of SR-1 was optimized in shake flask scale. It was found that SR-1 was produced high amount of antibiotic in modified R-1 medium which consisted of 0.5% Bacto peptone, 0.3% Beef extract, 1.0% Maltose, 0.25% Yeast extract and 0.5x10-5 M. MnCl₂, initial pH 7.0, temperature 35°C on shaking flask at 200 rpm. The cells were harvested after cultivation for 60 hours. Under these conditions, 24.36 unit/mg. cell mass of antibiotic was obtained. The antibiotic from SR-1 was determined as an intracellular substances. The cells were broken by freeze-thawed followed by lysozyme treatment. Whole cells extract were concentrated in 50% glycerol and then partially purified twice through the SEP-PAK C₁₈ and Sephadex G-25, respectively. According to these system, antibiotic from strain SR-1 was 16-folds increase in purification. The purified antibiotic was inhibited both gram-poitive bacteria; Bacillus cereus ATCC 11778, Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus megaterium ATCC 14581, Staphylococcus aureus ATCC 25923 and some fungi; Gliocladium sp. Paecilomyces variotii. Purified antibiotic was detected by RP-HPLC which showed single peak at retention time 2.15 minute. This antibiotic was estimated molecular weight about 9700 dalton, by using SDS-PAGE. To determine preliminary structure of purified antibiotic by the Infrared Spectrum, IR spectra appeared adsorption band at 3450, 1650 and 1450 cm, respectively. These indicated that antibiotic from strain SR-1 was peptide antibiotic. Purified antibiotic was mostly stable at emperature 30°C and pH 7.0-7.5; resisted to B-glucosidase, B-lactamase, lysozyme, papain and proteinase K, but slightly hydrolysed by pepsin and completely hydrolysed by trypsin.

จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. สำนักงานวิทยทรัพยากร

Address: กรุงเทพมหานคร

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: สุมาลี พิชญางกูร

Role: ที่ปรึกษา

Created: 2539

Modified: 2560-08-27

Issued: 2560-05-14

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9746331531

tha

DegreeName: วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต

Level: ปริญญาโท

Descipline: จุลชีววิทยา

Grantor: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

©copyrights จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	Rungaroon_wa_front[1].pdf	825.15 KB	3	2025-01-15 15:04:37
2	Rungaroon_wa_ch1[1].pdf	1.3 MB	2	2025-01-15 15:05:26
3	Rungaroon_wa_ch2[1].pdf	1.4 MB	2	2025-01-15 15:06:26
4	Rungaroon_wa_ch3[1].pdf	2.69 MB	2	2025-01-15 15:07:14
5	Rungaroon_wa_ch4[1].pdf	966.72 KB	2	2025-01-15 15:07:21
6	Rungaroon_wa_back[1].pdf	1.3 MB	2	2025-01-15 15:07:29

ใช้เวลา

0.028368 วินาที