การโคลนและการแสดงออกของยีนชีวสังเคราะห์พอลิไฮดรอกซีแอลคาโนเอตจาก Ralstonia eutropha สายพันธุ์ A-04 ใน Escheriahia coli

Cloning and expression of polyhydroxyalkanoate biosynthesis genes from Ralstonia eutropha strain A-04 in Escherichia coli

Name: สิริรัตน์ วิเศษคุปต์

keyword: การโคลนยีน การแสดงออกของยีน พอลิไฮดรอกซีอัลคาโนเอต เอสเคอริเคียโคไล

Abstract: พอลิไฮดรอกซีแอลคาโนเอต (PHA) เป็นพอลิเอสเทอร์ชีวภาพที่สังเคราะห์โดยจุลินทรีย์หลายชนิด Ralstonia eutropha สายพันธุ์ A-04 เป็นจุลินทรีย์สายพันธุ์ใหม่ซึ่งคัดแยกได้จากดินในประเทศไทย และมีรายงานว่าสามารถผลิตอนุพันธ์ของ PHA ได้หลายชนิด งานวิจัยนี้มีจุดประสงค์เพื่อศึกษาลำดับนิวคลีโอไทด์ โคลนและแสดงออกยีนชีวสังเคราะห์พอลิไฮดรอกซีแอลคาโนเอตของจุลินทรีย์สายพันธุ์ที่คัดแยกนี้ใน Escherichia coli เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพในการผลิต PHA ให้สูงขึ้น ผลการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนชีวสังเคราะห์พอลิไฮดรอกซีแอลคาโนเอต โดยวิธีปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR) ร่วมกับการใช้ชุดสำเร็จ GenomeWalker[superscript TM] Universal Kit พบว่าลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนชีวสังเคราะห์พอลิไฮดรอกซีแอลคาโนเอตจากจุลินทรีย์สายพันธุ์นี้ ประกอบด้วย 3 กรอบการเปิดอ่าน (ORF) ซึ่งมีขนาด 1,770 1,182 และ 741 คู่เบส ตามลำดับ โดยมีผลิตภัณฑ์ที่มีความเหมือนกับ R. eutropha สายพันธุ์ H16 สูงถึง 99% และมีความสัมพันธ์ใกล้เคียงกับเอนไซม์พอลิไฮดรอกซีแอลคาโนเอตซินเทส (phaC) เบต้าคีโตไทโอเลส (phaA) และอะซิโตอะเซทิลโคเอรีดักเทส (phaB) ของ R. eutropha สายพันธ์ H16 ตามลำดับ จากนั้นโคลนยีนชีวสังเคราะห์พอลิไฮดรอกซีแอลคาโนเอตและแสดงออกภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ araBAD ที่ถูกเหนี่ยวนำด้วยอะราบิโนส (pBAD/TOPO[superscript ®] ThioFusion[superscript TM] เวกเตอร์) ศึกษาการผลิต PHB ของรีคอมบิแนนท์ E. coli ในระดับขวดเขย่าโดยการแปรผันชนิดของอาหาร ความเข้มข้นของสารเหนี่ยวนำ (L-อะราบิโนส) และขนาดของหัวเชื้อเริ่มต้น ผลวิจัยแสดงว่าการเลี้ยงโดยใช้ขนาดของหัวเชื้อเริ่มต้น ผลวิจัยแสดงว่าการเลี้ยงโดยใช้ขนาดของหัวเชื้อเริ่มต้นน้อยและอาหาร LB ที่มีคาร์บินิซิลิน 50 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร และเสริมด้วย 1% L-อะราบิโนสให้น้ำหนักเซลล์แห้ง 6.11 กรัมต่อลิตรและปริมาณ PHB 5.7 กรัมต่อลิตร ใน 24 ชั่วโมง ซึ่งบ่งชี้ให้เห็นว่าการแสดงออกของยีนเหล่านี้ใน E. coli เป็นผลให้ได้ระดับ PHB ในสัดส่วนที่สูงเท่ากับ 93.3% (น้ำหนัก/น้ำหนัก) ที่ 24 ชั่วโมง เมื่อเปรียบเทียบกับจุลินทรีย์ต้นแบบ R. eutropha สายพันธุ์ A-04 ที่สะสม PHB สัดส่วน เท่ากับ 78% (น้ำหนัก/น้ำหนัก) ที่ 60 ชั่วโมง ดังนั้นความสามารถของรีคอมบิแนนท์ E. coli ในการแสดงออกกรอบการอ่าน phaCAB นำไปสู่การผลิต PHB ที่มีคุณลักษณะที่เหนือกว่าทั้งในด้านการเจริญและการผลิต PHB ที่รวดเร็ว

Abstract: Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are biodegradable polyesters synthesized by a wide variety of microorganisms. Newly isolated Ralstonia eutropha strain A-0.4 screened from soil in Thailand could produce high content of PHAs. Thus, the PHA biosynthesis genes of this strain were cloned, characterized and expressed in Escherichia coli for achieving higher productivity. The PHA biosynthesis genes were analyzed by PCR and gene walking techniques to obtain the intact genes. Three major open reading frames (ORFs) were obtained and found to be 1,770, 1,182 and 741 bp, respectively. Sequence analysis showed that they were closely related to the PHA synthase (phaC), beta-ketothiolase (phaA) and acetoacetyl-CoA reductase (phaB) genes of R. eutropha H16. The recombinant E. coli strain harboring phaCAB operons of R. eutropha strain A-04 was constructed and expressed under the control of the arabinose-inducible araBAD promoter (pBAD/TOPO[superscript ®] ThioFusion[superscript TM] vector). In flask cultivation, the PHB production of recombinant E. coli was investigated by varying types of media, concentrations of inducer (L-arabinose) and initial inoculum sizes. The obtained results showed that the cultivation using a low inoculum size and LB medium containing 50 µg/ml carbinicillin supplemented with 1% L-arabinose gave 6.11 g/l of dry cell weight and 5.7 g/l of PHB amount at 24 h. It is indicated that the expression of these genes in E. coli results in a high level of 93.3% (w/w) of PHB content at 24 h of cultivation comparing with the wild type R. eutropha strain A-04 accumulated 78% (w/w) of PHB content at 60 h. Thus, the ability of the recombinant E. coli to express the phaCAB operons leading to the production of PHB with superior characteristic in rapid growth and PHB production

จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. สำนักงานวิทยทรัพยากร

Address: กรุงเทพมหานคร

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: สุชาดา จันทร์ประทีป

Role: ที่ปรึกษา

Name: อรฤทัย ภิญญาคง

Created: 2552

Modified: 2557-12-28

Issued: 2557-11-26

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

tha

DegreeName: วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต

Level: ปริญญาโท

Descipline: เทคโนโลยีชีวภาพ

Grantor: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

©copyrights จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	sirirat_vi.pdf	20.26 MB	18	2020-10-18 06:50:26

ใช้เวลา

0.022464 วินาที